The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
Hovedparten af alle kendte sygdomme er ledsaget af lidelser i det kardiovaskulære system. Undersøgelser af kompleksiteten af de interagerende veje aktiveres under cardiovaskulære patologier er dog begrænset af mangel på robuste og fysiologisk relevante metoder. For at modellere patologiske vaskulære hændelser har vi udviklet et in vitro assay til undersøgelse af interaktionen mellem endothel og fuldblod. Assayet består af primære humane endotelceller, som er placeret i kontakt med humant fuldblod. Fremgangsmåden anvender native blod med ingen eller meget lidt antikoagulant, muliggør undersøgelse af delikate vekselvirkninger mellem molekylære og cellulære komponenter i et blodkar.
Vi undersøgte funktionaliteten af assayet ved at sammenligne aktivering af koagulation af forskellige blod inkuberet med eller uden humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC) mængder. Hvorimod en større blodvolumen bidraget tilen stigning i dannelsen af thrombin antithrombin (TAT) komplekser, tilstedeværelsen af HUVEC resulterede i reduceret aktivering af koagulation. Desuden vi anvendt billedanalyse af leukocyt tilknytning til HUVEC stimuleret med tumornekrosefaktor (TNFa) og fundet tilstedeværelsen af CD16 + celler til at være væsentlig højere på TNFa stimulerede celler sammenlignet med ikke-stimulerede celler efter kontakt blod. Afslutningsvis kan assayet anvendes til at studere vaskulære patologier, hvor interaktioner mellem endotelet og blodrummet er forstyrret.
Metoder til analyse af interaktioner blod-kar i hjertekarsygdomme involverer generelt dyreforskning eksperimenter. Resultaterne er oprettet i eksperimentel forskning dyremodeller kan dog have ringe eller ingen virkning på human sygdom. 1,2 Som sådan er der et behov for god og pålidelig in vitro-modeller til at undersøge cellulære interaktioner mellem blodrummet og vaskulære endotelceller en human-lignende system. Vi har derfor etableret en blod endotelcelle kammer model. Dette er baseret på en tidligere beskrevet model, der anvendes til at undersøge interaktionen mellem biomaterialer og humant fuldblod. 3 I modsætning til andre in vitro opsætninger, hvor normalt kun antallet af oprensede komponenter, dvs. thrombocytter, leukocytter eller endotelceller er til rådighed, den foreliggende model inkorporerer alle de tilstedeværende bestanddele i et blodkar.
Opsætningen af blodet endotel cell kammer model er designet til at muliggøre anvendelse af frisk udtaget humant blod med lidt eller ingen tilsat antikoaguleringsmiddel. Blod opbevaret i længere tidsperioder erhverve såkaldte storage læsioner, hvor opdeling af erythrocytter kan interferere med sarte interaktioner mellem blod og endotelceller. 4
For at undgå koageldannelse under håndtering af fuldblod ex vivo kræver enten høje doser af antikoagulans, eller at alt materiale i kontakt med blod skal være ikke-aktiverende. Som ikke-aktiverende overflader er sjældne i laboratoriet miljøet, kan materialer alternativt være forsynet med et beskyttende lag af immobiliseret heparin. Et beskyttende lag af immobiliseret heparin (i det følgende benævnt Corline heparin overflade (CHS)), der kan anvendes til de fleste materialer skaber en overflade, hvor kontakt blodet kan forekomme uden at forårsage en aktivering af koagulationskaskaden. 5 således ved at give kamrene med CHS, blod endotel cell kammer model muliggør brug af meget lave koncentrationer af antikoagulerende i blodet. Undgå tilsætning af høje koncentrationer af antikoagulerende i blodet endotel kammer model gør det muligt at studere følsomme interaktioner inden for et blodkar, som ellers ville være maskeret. 6
Blod endotelcelle kammer model består af to kamre, der er dannet ved at fastgøre plastcylindre (højde: 8 mm; radius: 9 mm) på en plast mikroskopobjektglas. Kanterne vender opad på cylindrene er udstyret med riller, som er forsynet med gummi-O-ring til tætning af kamrene mod cellekultur slide. Kamrene er kun delvis fyldt med blod, da luft i kammeret holder blod i bevægelse, når kamrene efterfølgende roteres i en lodret position (figur 1).
For at vurdere funktionaliteten af modellen, udførte vi forsøg med enten en helt CHS belagtkammer eller human navlestrengsveneendotelceller (HUVEC). To separate blodvolumener blev analyseret og dannelsen af thrombin antitrombin (TAT) komplekser (en indirekte markør for koagulation) blev målt med enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Vi derefter vurderet virkningen af blodvolumener og tumornekrosefaktor (TNFa) stimulerede endotelceller på leukocytrekruttering ved billedanalyse.
Figur 1. Opsætning af blodet endotelcelle kammer model. (A) Top vist skematisk tegning af blodkammeret fremstillet i PMMA. (B) Primære humane endotelceller dyrkes på 1-brønds kammerobjektglas. Tilsættes frisk humant fuldblod to kamre på et objektglas. Kamrene og alt materiale, der anvendes til håndtering af blod er behandlet med en beskyttende belægning HS. Efter fjernelse af væggene i cell kultur slide cellerne placeret overfor blod og systemet er fastspændt lukket. (C) Blodet endotelcelle kamre derefter inkuberet under rotation i 37 ° C. Bagefter kan reaktionerne i blodrummet analyseres ved ELISA og endotelceller kan analyseres ved mikroskopi.
Flere interaktioner mellem blodet og karvæggen normalt holdes i en hvilende tilstand på grund af ikke-klæbende og anti-thrombotisk karakter endotel. 7 Under patologiske tilstande, der involverer inflammation, er endotel aktiveret med en deraf følgende stigning i adhæsion-receptor-ekspression 8 og en nedsat evne til at hæmme hæmostase. 9 Aktivering af kaskadeanlæggene i blodet igen forstærker thrombogenicitet endoteliet forårsager yderligere trombose og leukocytrekruttering. 10. For at få en bedre forståelse af denne delikate interaktioner mellem endotelceller og fuldblod, vi har udviklet en hidtil ukendt in vitro-metode, hvor dyrkede endotelceller er placeret i kontakt med fuldblod. Til vores viden, vores setup er den første til at vise endotelceller inkuberet med humant fuldblod med ingen eller meget lidt antikoagulant i længere perioder.
nt "> Følsomheden af dette system er aktiveret som åbent system venepunktur i kombination med et beskyttende lag af immobiliseret heparin på alle overflader i kontakt med blod. Brugen af et åbent system under indkøb blod reducerer aktivering af kaskadeanlæggene under venepunktur mens tillader anvendelse af en selvbestemt mængde antikoagulans. Kommercielt tilgængelige evakueret blodprøverør kan dog anvendes afhængigt af den tilsigtede slutpunkter af undersøgelsen. Den endelige koncentration af antikoagulerende føjet til de fleste kommercielt tilgængelige lukket system rør kan hæmme følsomme og ellers er svært at studere, interaktioner i opsætningen. 6 A beskyttende heparin overflade yderligere eliminerer aktivering af blod gennem kontaktflade med andre midler end de endotelceller overflader. 5 Faktisk inkubation af fuldblod suppleret med en lille mængde af ufraktioneret heparin i kammer uden beskyttelse af CHS resulterede i koageldannelse. <pclass = "jove_content"> The luftboble inde i kammeret muliggør blanding af blod under inkubation med endothelceller. For at vurdere virkningen af den luftboble størrelse, vi anvendt to forskellige mængder blod. I denne model har vi målt lignende TAT niveauer uanset luftboble størrelse i kamre inkuberet med HUVEC. TAT blev imidlertid forøget med en mindre luftboble størrelse i fuldt CHS behandlede kamre. Dette i overensstemmelse med tidligere beskrevne endotelceller egenskaber 11, angiver en regulerende virkning på den øgede aktivering af koagulation, som de endotelceller, der mangler i den inerte CHS kammer. Luftboblen i systemet skaber en strøm ved rotation af kammeret. Størrelsen af boblen vil påvirke de kræfter inden for denne roterende system. Dette fremgår af vores resultater i figur 2D var en mindre boble skaber højere TAT værdier repræsenterer en nedsat kraft, når blodet dvs blod bevægelseinden i kammeret er lavere og dermed aktivering af kaskadeanlægget forekommer i højere grad. Det bør nævnes, at vi i dette system skaber en roterende strøm, der vil være anderledes i hastighed på tværs af kammeret med den højeste hastighed langs væggene og den laveste i midten. Dette er naturligvis ikke et optimalt miljø med hensyn til strømme og forskydningsspænding for endotelceller, men stadig har vi et system producerer stabile og reproducerbare resultater. Mere optimale betingelser vil omfatte cirkulerende laminar strømning i fravær af turbulens. Dette er imidlertid ikke muligt i modellen repræsenteret her og vores viden sådant system ikke er til rådighed til dato. Selv om der er flere mikrofluide systemer kommercielt tilgængelige, som ikke er muligt at kombinere med fuldblod med ingen eller lave niveauer af antikoagulerende tilsat til systemet derved ikke muligt korrekt følsom evaluering af interaktionerne mellem alle komponenter i blodet og endotelceller.Desuden var der en 2-fold stigning i rekruttering af blodceller mod TNFa aktiverede HUVEC i kombination med en fordoblet dannelse af TAT uafhængigt af blodvolumen. Dette bekræfter stabiliteten af modellen, og viser også muligheden for at anvende en aktiveret endotel i kombination med fuldblod. Fremtid på, kan blodet endotelcelle kammer anvendes til at undersøge blod celletilgang mod aktiverede endotelceller ved en række af markører udtrykt på celler under forskellige betingelser og stadier af aktivering. Endvidere kan modellen anvendes i kombination med farmakologiske midler for at evaluere virkninger på inflammatoriske tilstande.
Sammenfattende viser vi stor gavn af at kombinere et kammer model med humant blod og vaskulære celler for at skabe et helt menneske in vitro system til at udføre de relevante undersøgelser af karsygdom.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra forskningsrådet svensk (90293501, A0290401, A0290402), Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram under tilskudsaftale n ° 602699 (Direkt) Den NovoNordisk Fonden, Gurli og Edward Brunnberg Foundation, Stem Therapy, Vleugel Foundation og Åke Wiberg Foundation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
EDTA | Sigma | E-6758 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
Clamps | Office Depot | 2052204 | |
Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
Light microscope | Nikon | TS100 | |
Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |