指南现代荧光定量免疫印迹与故障排除策略

该协议已经使用商业化生产的缓冲器，凝胶和转印栈，以减少可变性，并提高一致性进行优化。参阅材料清单所需的消耗品的完整列表。 使用I-Blot检测快速传输和LI-COR的奥德赛成像系统，荧光白平衡协议 1.样品的制备缓冲区选择/制备选择用于样品均质化的适当的提取缓冲液，并确保该缓冲器是适用于所有的下游的技术来使用。制备的提取缓冲液：RIPA缓冲液（25mM的Tris-HCl（pH为7.6），150 mM氯化钠，1％NP-40,1​​％脱氧胆酸钠，0.1％SDS）中含有样品分离前5％的蛋白酶抑制剂混合物。 注意：有许多不同类型的提取缓冲液可与这取决于细胞内目的蛋白质的位置被选择。这些包括但不仅限于RIPA缓冲液（全细胞，线粒体和核部件），NP-40裂解液（全细胞或膜结合）和三海卫（细胞质骨骼绑定）。但是，提取缓冲液中的一些化学清洁剂可能有助于溶解，甚至停用蛋白质，但蛋白质测定使用特定的蛋白质测定法时， 即二喹啉酸（BCA）检测的干扰。检查关于与测定的化学相容性的制造商的指导方针。 蛋白提取/溶采用使用一个DOUNCE或手持式电动匀浆与聚丙烯尖端在所制备的提取缓冲液，在大约1点10重量/体积（组织重量/缓冲液体积），随后均化剪刀和/或手术刀直到手动浸软的组织样本平滑/一致的匀浆制备。 注：对于较小的，珍贵的/很难获得样本，基于洗涤剂提取CAÑ​​仍然是有效降低到1：5。 发表均质，离心样品以20,000×g离心20分钟，在4℃下。直到需要除去含有溶解的蛋白质和商店的上清液在-80℃下。保留不溶性的颗粒，以允许进一步更严格的提取，如果以后需要。继续进行蛋白质测定步骤1.3。 蛋白质测定确定通过使用一个BCA，布拉德福德或相似的测定提取的各样品中蛋白质的浓度。当计算的标准曲线，确保了确定比，R平方值的系数，是大于或等于0.99，反映了样品15内的最准确的测定蛋白质丰度。 注：由QFWB被比较的所有样品必须检测对同一标准曲线。 样品的制备规划和记录梯子和样品的加载顺序2相同克埃尔斯：凝胶1用于转移和凝胶2作为上样对照。负载的控制和“治疗”的样品依次以避免可能出现的不良或明确转让任何偏见。 计算所需的各样品的蛋白量。一个标准的蛋白质负荷检测蛋白质在神经元分离是15微克。使每个样本高达10微升体积用卫生署2 O.加入5微升加样缓冲液，涡旋和热，在98℃下进行2分钟。 包括一个阳性对照样品，如重组蛋白以辅助识别感兴趣的正确频带。但是正确制备阳性对照样品按照制造商的指导原则，避免选择错误的频带。参见图1。 图1：Positive控制选择。一个实验中加入的阳性对照的确认检测到的标签是真实的。但是，一定要小心，以确保您的控制工作正常之前，用实验样品A）融合蛋白TREM 2在制造商的1微克/毫升指引加载，但是在110 kDa的与数据表的冲突中观察到的标记预测分子重量的60-70 kDa的。B）的加法和温育与还原剂后，将融合蛋白标记物在预测的分子量检测。然而，这意味着更大的蛋白负荷所需的还原方法减少该蛋白质的信号。 蛋白质2.电泳分离 4-12％双/三凝胶制剂（1.0毫米） 注释：梯度凝胶被用来在宽分子量范围内，以产生更大的蛋白质的分离。 选择并准备MES或MOPS电泳缓冲液（每罐1升）通过与卫生署2 O稀释MES缓冲液中产生更好的分辨率的蛋白质内3.5-160 kDa的而MOPS运行缓冲液是优选的，以检测的较高分子量的蛋白质高于200 kDa的但是将具有低于15 kDa的低分子量蛋白质的较差的分辨率。 取出梳子和胶带条，覆盖凝胶的脚。轻轻冲洗各孔用使用1ml移液器在运行缓冲液中。填充井用运行缓冲液中，并确保没有气泡残留在凝胶中。 凝胶制备和装载将凝胶放入水箱，并填补了凝胶间舱室与电泳缓冲液，以确保所有密封件均有效地工作。 加入3微升的分子量标准到第一口井凝胶1和凝胶2.将10微升每个样品到后来的水井。 注：除梯子，凝胶1＆2凝胶必须相同。当务之急是日在使用凝胶2预染分子量标准，以便使用总蛋白染色是在奥德赛成像仪的700通道时可见的蓝色和可见的。 一旦被加载两种凝胶，填充剩余的运行缓冲罐和固定盖子。 电泳 “运行”的凝胶在80伏进行4分钟，以确保样品进入以均匀的方式在聚丙烯酰胺凝胶基质。其后增加电压和时间设置为180 V 50分钟，分别或直至样品染料可以看出，在凝胶的脚。 注：较高的电压可被施加以实现更短的运行时间。然而，这可能会导致“笑脸”的凝胶，其中所述凝胶的中间样本的运行速度比所造成的温度上升14的外车道的样品要快。 在加载控制凝胶3.总蛋白染色从磁带盒使用释放凝胶2凝胶刀。除去孔中，凝胶的脚。凝胶上标记，以帮助定向。 倒出大约30毫升的蛋白质染色成方形培养皿（尺寸约12×12厘米）。放置凝胶2入蛋白质污点，从而确保该溶液覆盖整个凝胶，然后搅拌该凝胶1小时，最小值在室温下进行染色。 倒出蛋白染色和在蒸馏水中之前可视洗凝胶3倍。继续执行步骤6.3可视化。 4. I-印迹半干快速蛋白转移注意：需要使用I-Blot检测机蛋白转移的所有试剂都是专门针对我印迹方法设计的商业产品和所用的材料清单中找到。 准备“底”转让协议栈。取下铝箔盖和预湿用电泳缓冲液直接从胶罐。预湿滤纸，用蒸馏水。 重复步骤3.1和地点凝胶1到准备“底”转栈。 放置在凝胶预湿滤纸。滚动滤纸和凝胶，以确保没有气泡的各层之间的残留。 从顶部传送栈中取出铝箔盖和铺设在滤纸上和底部堆栈的顶部的顶部堆叠。滚动转栈“三明治”，以消除任何气泡。 从传输堆栈套件的海绵插入到I-Blot检测机的盖子。将转栈三明治到I-Blot检测机上的专用空间，然后盖上盖子固定。启动I-Blot和转移8.5分钟的节目3。 如果有一个低蛋白信号或高不均匀：低分子量蛋白质之比，使用半干燥的“快速”的转移方法时，测试该制造商的传输时间。运行使用相同的负载的样本重复序列，以确定理想的转移电压/时间组合的简单优化协议如在图2中看到的 。 图2.优化装载有阶梯的单一凝胶转移使用I-Blot法A）和15的三个串联重复序列的小鼠全脑匀浆微克切成三部分。一部分未被转印，1被转移为7.5分钟（按照制造商的指导方针），一个用于8.5分钟。凝胶切片，然后用即时蓝蛋白染色剂染色，扫描上的680通道的红外成像和量化。B）的量化值，表明在每个凝胶的残留蛋白质含量的差异的图形表示后面的0，7.5，和8.5分转移。注意，传送时间的额外分钟造成了大约45％的额外蛋白质转移。e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg“TARGET =”_空白“>请点击这里查看该图的放大版本。 5.抗体检测蛋白膜的制备及阻塞从I-Blot检测机除去转印堆栈。除去顶部和滤纸层暴露在底部传送栈中的凝胶。 切断周围的凝胶用手术刀，并确保一个三角形切向定位是表示在该膜。下面的膜裁剪，蛋白质染色凝胶来检查传输效率和/或丢弃。 迅速将膜放入干净的50ml管中（或等值插座）含有5ml 1X PBS中，并放置到一个机械滚轮（或轨道平台）的不断搅拌。 注意：这是至关重要的，所述膜是不允许干。在半干转印膜将成为热点。等待2分钟打开转栈，因为这将允许我之前吨冷却，并在堆栈解构缓慢的干燥时间。使用的辊筒和用于在洗涤和孵育搅拌允许显著减少所需的溶液的量。 洗膜3×5分钟，在1×PBS中。丢弃的1×PBS和块与未稀释的封闭缓冲液的膜为至少30分钟，在室温下进行。 一抗准备。 根据制造商的在5ml封闭缓冲液中含0.1％吐温20的指引制备第一抗体。孵育制备的第一抗体过夜，在4℃下以恒定的搅拌的膜。 注：封闭缓冲液，通常使用未稀释的，而是可以稀释到1：4，用PBS如果初级抗体具有足够高的特异性。 弃去第一抗体和洗膜6次，每次5分钟，用1×PBS。 二抗的选择和准备山高ndary只标注评估控制的目的，省略步骤5.2.1和5.2.2以上，并继续执行步骤5.3，以确定具体的抽样二次带型。参见图3。 图3.优化二次抗体。A）二次唯一的非特异性标记的抗鼠15微克（M）多品种比较，羊（O）和马（E）神经组织匀浆与各种荧光标记的二抗。 L是分子量阶梯。绵羊组织匀浆是唯一的样品与次级标记用驴抗山羊800抗体。 乙当交叉反应）也很重要，如果使用不同的组织样本时出现的非特异性标记，以确定， 例如 ，鼠腓肠肌（15 _6克负荷）。该样品的交叉反应与驴抗小鼠680的二级​​抗体，但用小鼠脑匀浆时，这并没有发生。 制备荧光标记的第二抗体680或800（红色或绿色通道），按照生产商推荐的浓度在封闭缓冲液中含0.1％吐温20。孵育在黑暗中的膜用90分钟在室温下持续搅拌制备的二级抗体。 丢弃的二级抗体和洗膜6次，每次洗涤5分钟，用1×PBS。继续执行第6步 – 可视化。 如果标记的可视化工作不正常，检查梯子射程二次抗体作为一个合适的附加步骤。不是所有的二抗允许所有标记带的可视化市场上所有的梯子。 如果预期的频段是不可见的，使用其他辅助主机， 也就是说，反主动安永抗兔抗山羊抗兔表示合适的协议修改。参见图4。用于提高二抗宿主物种有时会导致一个问题，可视化，由于缺乏特异性针对特定初级抗体。 图4.故障的第二抗体特异性的范围组织样品的Western印迹（每泳道15微克蛋白） -脂肪，肌肉，肝脏和骨-孵育ERK的初级抗体孵育用三种不同的二抗。顶板：WB标记LI-COR的山羊抗兔680第二抗体产生的脂肪和骨弱的标签和在肝脏和肌肉样品中没有检测到信号。中间面板：膜（从顶部面板）进行剥离和再版俄别用ECL方法和山羊抗兔HRP连接的次级。频带是现在在肌肉和肝脏样品可见和标签出现的脂肪和骨样品中更加强烈。底部面板：膜（从顶部和中间面板）进行剥离，并使用LI-COR的驴抗兔已经示出了ERK的初级抗体具有更大的亲和力680的二级​​抗体再次探测。标签的肌肉和肝脏现已与来自脂肪和骨骼样本增加信号强度显示。 请点击这里查看该图的放大版本。 6.可视化注：所有图片均采用LI-COR的奥德赛经典成像仪和相关的专业图像分析软件（3.1.4版本）获得的。 打开并登录到计算机和成像。打开成像软件并创建一个新的文件。 见图5。 <p class="“jove_content”FO：保together.within页=“总是”"> 图5.可视化和Western blot定量分析。扫描免疫印迹显示小鼠腓肠肌（30微克负载）的探测与膜联蛋白V一抗（36 kDa的）和羊抗兔800的第二抗体。膜进行扫描，并可视化中的800信道。量化蛋白质（膜联蛋白V），一个矩形框，从样品1周围绘制的感兴趣的频带这随后被复制和粘贴在剩余样品泳道，以确保在同一区域的测量。背景自动占周围绘制的形状，但这是可以改变的，以确保在后台测量是精确限定的。下面的表格显示绘制包括信号与背景相减得到的总信号，背景和每个形状的量化测量。这些信息可以被导出到一个电子表格程序来计算的表达率（相对于荧光强度来确定），并允许进行后续的统计分析。 请点击这里查看该图的放大版本。 打开热像仪的盖子。倒入少量的1×PBS对上的左下角的玻璃，然后将膜在PBS中的顶部。确保膜是正方形与成像器的轴和1厘米的间隙被留在膜和网格轴之间。 滚动膜，以确保无气泡的玻璃和膜之间困住。 算膜占据的x和y轴的正方形的数目。关闭成像仪的盖子。进入膜占据的计算机软件的正方形的数目。 选择合适的信道进行扫描，将依赖于荧光标记的膜二次抗体，的即 700信道或当一个680或800的荧光标记的抗体已被分别用于800信道。当双标记被执行时，扫描在两个通道。 注：优化单一的蛋白标记进行双标记之前。 选择的强度来扫描该膜，如果一个高丰度蛋白使用低强度的扫描。另外，如果第一抗体对目的蛋白选择更高强度的扫描亲和性差， 即 5级按启动键开始扫描。请转至步骤6.4。 装载控制凝胶的可视化（ 图6）。 图6.总蛋白标记和分析。A）含有20微克每车道。B马颈椎神经节匀浆总蛋白凝胶标记的照片），从面板凝胶利用成像软件扫描中从总蛋白质染色的凝胶的680信道。C）的图形图像的量化测量获得。一系列的测量，由分子量标记物来确定， 即，30-110 kDa的，采取以提供测量值的直方图，以确保标准误（SEM）为低（被分组的试样的），这表明总蛋白水平在每个样品中是均匀整个凝胶。 请点击这里查看这个数字的放大版本。 按照步骤6.1和6.2。 倒入蒸馏水在玻璃制的网格中的轴开始处的成像器的底部角落。 将凝胶上的水的顶部和操纵这样的车道垂直于任一x或网格的y轴方向。离开网格的y和x轴和凝胶之间1cm的间隙并计算凝胶占据在网格轴线方格的数目。近热像仪​​的盖子。 进入凝胶占据的计算机软件的正方形的数目。 选择的700信道扫描的总蛋白质染色的凝胶。 注：蓝色荧光，在700频道。 强度设置为5，然后按开始。 扫描图像的量化调整亮度和对比度的按钮，以产生最佳的图像质量。如果似乎存在高背景噪声，重新扫描该膜在较低的强度，并使用高质量的扫描设置。 注：任何调整都不会改变扫描时获得的荧光数据。 旋转图像90°，180°和270°，以查看在所期望的方向，没有修改所获取的数据。然而，使取向“自由旋转”的小调整，以大于3°时，在像素化值采集的数据可以被扭曲，从而影响定量结果。 然后从菜单形状的形状 – 使用一个矩形在大多数情况下 – 与周围绘制的感兴趣的频带（WB）或在样品泳道1的整个车道（总蛋白胶）。 复制并粘贴跨越的利益或整个车道样品2道带的形状。对面的对每一取样兴趣各个频带和各车道总蛋白凝胶重复。 检查背景测量不包含的信号，在未来的车道。背景可以通过软件自动扣除，并包括周围绘制的形状的整个边缘或它可被指定为顶/底部或左和形状的右边。或者，指定一个用户自定义的背景框。 显示形状表中的任意荧光单位绘制每个形状的信号。背景将自动从该信号中扣除。 图像导出为TIF文件，查看不同的软件。不导出图像和操纵USI纳克非图像pro软件，因为这会改变由成像器生成虚假数据中获取的原始数据。 重复步骤6.4.3-6.4.7量化双标记或进行多次测量的装载控制凝胶生成和整理标准错误数据时。 7.邮政可视化保持膜在1×PBS或干出用于长期储存以供将来重复探测和剥离膜的对于感兴趣的其他蛋白质。 剥离和重新探测膜。 见图7。 图7.膜剥离和再杂交，膜下扫描红外成像系统， 一个不同的剥离步骤代表性的例子。第一免疫检测，进行与CSP的第一抗体（兔）和扫描在700路; B。首先剥离和ROCK2（兔）与800路再杂交。橙色箭头指示剩余的条和重新探头后，目前CSP的主要抗体。这并不影响ROCK2的测量作为带处存在较高分子量（白色箭头）。13 C。第二次剥离，并与β-血影蛋白抗体（山羊）再次探测和可视化的800通道。ð。第三剥离，并与α突触核蛋白抗体（兔） 的 E再杂交。第四剥离，并与泛素抗体（小鼠）与800路再杂交。还有从最后抗体剩余信号（α突触核蛋白。橙色箭头）。F。第五剥离和CALB2抗体（兔）成像在700路再杂交。所用的二抗是：山羊抗小鼠800CW，山羊抗兔680rd，山羊抗兔800CW，驴抗山羊800CW（见材料清单）。巷标签：L – 梯1/260; -样品的1/2。 请点击这里查看该图的放大版本。 地方膜（多个）中的正方形培养皿中含有大约30毫升Revitablot剥离缓冲液，并在室温下恒定搅拌5-20分钟之间温育。 洗膜（多个）在PBS中的3次，然后重新扫描成像器，以确保完全除去荧光的发生 – 此步骤，每一个条带后重复进行。 孵育膜（S）的时间较长，如果荧光仍然存在。重新扫描每个膜带后，确认有没有剩余的二次信号。 注意：膜（多个）应只剥离并再次探测最多3次，以确保膜的完整性没有被破坏从而导致不​​期望的高背景信号比。