Summary

Toprak Örnekleme ve Entomopatojenik Nematodlar İzolasyonu (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Published: July 11, 2014
doi:

Summary

Entomopatojenik nematodlar böcek geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan yuvarlak solucan bulunmaktadır. Sırasıyla toprak örneklerinin ve enfekte olmuş böcek kadavra, nematod geri kazanılması için böcek kızdırma ve modifiye edilmiş beyaz tuzak: iki teknikler kullanılarak topraktan bu nematod izolasyonu için kullanılan örnekleme yöntemlerini göstermektedir.

Abstract

Entomopatojenik nematodlar (aka EPN) böceklerin geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan nematod bir grubu temsil eder. Steinernematidae ve Heterorhabditidae: Bu nematod iki aileye aittir. Şimdiye kadar, 70'in üzerinde tür Steinernematidae tarif edilmiştir ve yaklaşık 20 tür Heterorhabditidae de vardır. Nematodlar Enterobacteriaceae bakteri ile bir ortaklık mutualistik ve birlikte böcek türlerinin geniş bir yelpazede öldüren kuvvetli bir insektisid kompleksi olarak hareket ederler.

Bu yazıda, topraktan EPN toplamak için düşünülen en yaygın teknikler üzerinde durulacak. Bu sunumun ikinci bölümü böcek-kızdırma tekniği, toprak örneklerinden EPN izolasyonu için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, ve enfekte olmuş böcekler bu nematod kurtarma için kullanılan modifiye Beyaz tuzak tekniği üzerinde duruluyor. Bu yöntemler ve teknikler EPN kültünün başarılı kurulması için önemli adımlarLaboratuvarda ayrıca ures diğer biyolojik disiplinlerde araştırma için bir model organizma bu nematod dikkate diğer biyoanalizlere için temelini oluşturur. Bu sunumda gösterilen teknikler SP Stock laboratuar üyelerinin yanı sıra, çeşitli yazarlar tarafından tarif edilenler ile gerçekleştirilebilir ve / ya da tasarlanmış karşılık gelir.

Introduction

Birçok nematod böcekler ile ilişkili, ve ev sahibi ilişkileri yararlı gelen zararlı değişir edilir. Burada, aynı zamanda entomopatojenik nematod (veya EPN) olarak bilinen böcek patojen nematodlara, bir grup üzerinde odaklanır. Steinernematidae ve Heterorhabditidae 11,13: İki nematod aile nematod bu gruba aittir. Onların patojenik etkisi fakültatif anaerobik enterik bakteriler (Wenorhabdus bakteri heterorhabditids ile ilişkilendirmek steinernematids ve Fotorhabdus bakteri ile ilişkilendirmek) 2 ile etkileşimi tarafından kazandırılan aslında. Bakteri toprakta yaşayan tek serbest yaşayan nematod aşamasında, (ayrıca Dauer yavru, enfektif yavru veya IJ olarak da bilinir) üçüncü aşama enfektif yavru, tek böceğin diğerine vectored edilir. Bir kez böcek içinde, nematodlar büyük septisemi ile böcek ev sahibi öldüren, böceğin hemolimf içine bakteri bırakın. Ayrıca, bakterilerböceğin dokularını aşağılamak ve onları olgun ve çoğalmaya izin nematodların 'besin kaynağı olur. Genellikle, yetişkin nematod bir veya iki kuşak böcek kadavranın içinde üretilmektedir. Birkaç bakteri hücreleri ile son nesil yetişkin yeniden ilişkilendirir soy, daha önceki beslenme ilişki daha şekilde uzmanlaşmış ve onlar parasitize başka böcek bekleyecek toprağa böcek karkas dışarı hareket olarak bağırsaklarında bu hücreleri beslemek 6,11,14 (Şekil 1).

Onlar tarım zararlıları 3,4,5 olan böceklerin geniş bir yelpazede parasitize gibi 1927 yılında keşfedilmesinden bu yana, EPN'dir kimyasal pestisitlerin değerli alternatifleri kabul edilmiştir. Ancak, son iki yılda, bu nematodlar ve simbiyotik bakterilerin konak-mikrop ETKİLEŞİMİ biyolojik, ekolojik ve evrimsel yönlerini incelemek için uysal bir model sistem olarak kabul edilmiştirns 14.

Bu sunumun amacı yöntemleri ve en yaygın toprak örneklemesi ve EPN izolasyonu için kullanılan teknikleri göstermektir. Çeşitli araçlar mevcuttur ve dahil olmak üzere toprak örnekleri toplamak için kullanılabilir: Toprak corers, mala, post-delik kazma, burgular, örnekleme tüpleri, el kürek, diğerleri arasında (Şekil 2).

Çalışmanın amacına bağlı olarak, iki örnekleme stratejileri olarak kabul edilebilir: a) tabakalı, b) rastgele örnekleme (Şekil 3). Tabakalı örnekleme genellikle belirli bir zaman süresi boyunca belirli bir ya da demarked alanda yoğun bir çalışmanın bir parçası olarak kullanılır. Genel olarak, bir transect demarked ve toprak örnekleri belirli bir süre (Şekil 3A) üzerinde 15 transect belirtilen aralıklarla alınır. Geniş bir alanda odaklanarak zaman rastgele örnekleme genellikle kullanılır. Bu numune alma stratejisi EPN f çeşitliliğini incelemek için kullanılmıştırgeniş bir coğrafi alana veya bölge (Şekil 3B) 12 rom. Bir dizi faktör yüksekliklerde, toprak dokular ve habitatları (örn.., Ekili alanlar, ormanlar, meralar, parklar, kıyılarda, nehir kıyısı alanları, vb) çeşitli bir yelpazede de dahil olmak üzere çalışmanın odak bağlı olarak kabul edilebilir.

Başlangıçta yatak ve Akhurst 1 tarafından tarif edildiği ve toprak numunelerinden EPN geri kazanılması için basit ve seçici bir alternatif temsil eder böcek yem tekniği göstermektedir. Bu nematod (IJ aşama) bir böceğin çekti ve onu parasitize olacağını öncül dayalı bir seçici işlemdir. Bu teknik aynı zamanda, diğer böcek mantar gibi patojenlerin ve bakterilerin izolasyonu için 8,10 olarak kabul edilebilir.

Ayrıca enfekte olmuş böcek ana 7,14 ikinci nematod döl almak için kullanılan modifiye edilmiş beyaz tuzak tekniği göstermektedir. Bu araya bir zahmetsizaşağılayıcı böcek kadavra enkaz ücretsiz 'temiz' bir nematod döl alma avantajı sunuyor hod.

Son olarak, tarif edilen ve bu makalede gösterilen teknikler tasarlanmış ve / veya laboratuarda yanı sıra çeşitli arkadaşları ve arkadaşları tarafından tarif edilenlere gerçekleştirilen edilenlere tekabül eder.

Protocol

1.. Toprak Örnek Toplama Her örnekleme site için 4 m 2 – 2 minimum alanı kapsayan düşünün. En az 15 cm derinlikte (Şekil 4) de toprak örnekleri toplamak. Bu alanda en az 5 rastgele numune almak. Örnek başına 3 Alt-numûnelerin al. , Çalışmanın amacı bağlı numûnelerin birleştirmek veya onları ayrı tutmak ya. Bir plastik torba içinde her örnek yerleştirin. Numunelerin sızmasını (Şekil 4) önlemek …

Representative Results

Toprak Örnek Toplama EPN Üçüncü aşama enfektif gençler toprakta (Şekil 1) ikamet bu Nematodlar 'yaşam döngüsü içinde sadece özgür yaşam evreleri vardır. Bu nedenle toprak örnekleri toplayarak bu nematod kurtarmak için çok etkili bir yöntemdir. 4 örnek alınması gereken hangi derinliğini gösteren bir toprak profili göstermektedir. Bir numunenin nem korunması nematodların hayatta kalmak için önemli bir faktör…

Discussion

Bu gösteri genellikle EPN ve simbiyotik bakteri eğitim için kullanılan tekniklerin bir dizi tanımlamak iki sunumlar ilk. Bu teknikler laboratuvarda EPN kültürlerin başarılı kurulması için önemli adımlar temsil ve aynı zamanda araştırma için bir model organizma EPN kullanır diğer biyoanalizlere için temelini oluşturur.

EPN Çeşitli zemin etütleri onların bolluk ve dağıtım mevsim, habitatlar ve coğrafi bölgelere 4, 5,9,15 arasında farklılık olduğunu…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu protokollerin birçok iyileştirme katkıları için Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta ve Victoria Miranda-Thompson: Yazarlar Stock laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz Ulusal Bilim Vakfı desteği kabul SP Stoku (hibe IOS-0840932 ve IOS-0724978).

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Galleria mellonella Timberline http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG for insect baiting technique
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose Whatman/VWR 28450-048 infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri Dishes VWR 25384-092 infection chamber and White trap assembly
100 x 15 Petri Dishes VWR 25384-088 infection chamber and White trap assembly
ZIPloc Plastic Bags Ace Hardware or local hardware store N/A soil sampling
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml VWR 89130-562; 89130-566  infection chamber and White trap assembly
pippetor tips 1000ml, 200 ml VWR 16466-004 ; 53510 infection chamber and White trap assembly
Bleach Ace Hardware or local hardware store N/A soil sampling , desisnfecting
Sodium Hypochlorite Ace Hardware or local hardware store N/A soil sampling , desisnfecting
70% Ethyl alochol AAPER 17212945 soil sampling , desisnfecting
Shovels Ace Hardware or local hardware store N/A soil sampling
Tubular soil sampler Accuproducts N/A soil sampling
Soil Probe, long handle Nupla  PRB4T 69401 Classic soil sampling
Measuring tape Ace Hardware or local hardware store N/A soil sampling
Flagging tape, various colors Ace Hardware or local hardware store N/A soil sampling
tissue culture flasks VWR Falcon, 29185-304  White trap, collection of EPN
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth VWR 16650-107 White trap, collection of EPN

Referencias

  1. Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
  2. Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. . The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. , 473-488 (2007).
  3. Gaugler, R. . Entomopathogenic Nematology. , (2002).
  4. Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , (1990).
  5. Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
  6. Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
  7. Kaya, H. K., Stock, S. P. . Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
  8. Lacey, L. A. . Manual of techniques in invertebrate pathology. , (2012).
  9. McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
  10. Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
  11. Poinar, G. O. . Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , 23-61 (1990).
  12. Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
  13. Stock, S. P., Hunt, D. J., Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. , 3-43 (2005).
  14. Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
  15. Stuart, R. J., Gaugler, R. Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes. Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).
  16. White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
check_url/es/52083?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), e52083, doi:10.3791/52083 (2014).

View Video