דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)
Summary
נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.
Abstract
נמטודות Entomopathogenic (aka EPN) מייצגות קבוצה של נמטודות מאכלסת-האדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. נמטודות אלה שייכות לשתי משפחות: Steinernematidae וHeterorhabditidae. עד כה, יותר מ -70 מינים תוארו בSteinernematidae ויש כ 20 מינים בHeterorhabditidae. יש לי נמטודות שותפות mutualistic עם חיידקי Enterobacteriaceae ויחד הם פועלים כמתחם קוטלי חרקים רב עוצמה שהורג מגוון רחב של מיני חרקים.
במסמך זה, אנו מתמקדים בטכניקות הנפוצות ביותר נחשבות לאיסוף EPN מהקרקע. החלק השני של מצגת זו מתמקד בטכניקה מתגרה חרקים, גישה בשימוש נרחבת עבור הבידוד של EPN מדגימות קרקע, ואת טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת להתאוששות של נמטודות אלו מחרקים נגועים. שיטות וטכניקות אלה הן שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של כת EPNures במעבדה וגם יוצר את הבסיס למבדקים אחרים, כי רואים נמטודות אלה כאורגניזמים מודל למחקר בתחומים ביולוגיים אחרים. הטכניקות שמוצגים במצגת זו מתאימות לאלו שבוצעו ו / או שעוצבו על ידי חברי המעבדה בורסת SP, כמו גם אלה שתוארו על ידי מחברים שונים.
Introduction
נמטודות רבות הקשורים לחרקים, ואינטראקציות המארח שלהם נעות בין מועיל למזיק. במסמך זה, אנו מתמקדים בקבוצה של נמטודות, כי הם פתוגנים של חרקים, הידוע גם בנמטודות entomopathogenic (או EPN). שתי משפחות נמטודות שייכות לקבוצה זו של נמטודות: Steinernematidae וHeterorhabditidae 11,13. ההשפעה פתוגניים שלהם היא בעובדה שמעניקה את האינטראקציה שלהם עם חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים enteric (חיידקי Xenorhabdus לקשר עם steinernematids וחיידקים Photorhabdus לקשר עם heterorhabditids) 2. החיידקים וקטורים ממארח חרק אחד למשנהו על ידי את הבמה רק נמטודות חיים החופשית, לנוער בשלב השלישי התולעת (הידוע גם בנוער dauer, לנוער התולעת או IJ), שחיה בקרקע. ברגע שנכנס החרקים, נמטודות לשחרר את החיידקים לתוך hemolymph של החרקים, שהורג את מארח החרק על ידי הרעלת דם מסיבית. החיידקים גםבזות רקמות של החרקים ולהיות מקור המזון 'נמטודות, ומאפשר להם להגיע לבגרות ולהתרבות. בדרך כלל, דור אחד או שניים של נמטודות המבוגר מיוצר בתוך פגר החרקים. הצאצאים של reassociates הדור המבוגר שעבר עם כמה תאי חיידקיים במתמחים יותר בצורה מאשר היחסים התזונתיים הקודמים שלהם, ולטפח את התאים האלה במעיים שלהם, כאשר הם עוברים מ פגר החרקים לתוך האדמה שם הם ממתינים לחרקים אחר לparasitize 6,11,14 (איור 1).
מאז הגילוי שלהם ב1927, EPN היה נחשב חלופות בעלות ערך לחומרי הדברה כימית כפי שהם יכולים parasitize מגוון רחב של חרקים, כי הם מזיקים חקלאיים 3,4,5. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, נמטודות אלה וחיידקים סימביוטיים הוכרו כמערכת מודל נזיל לחקר היבטים ביולוגיים, אקולוגיים והאבולוציוני של interactio מארח-חיידק14 NS.
המטרה של מצגת זו היא להראות את השיטות וטכניקות הנפוצות ביותר לדגימת אדמה ובידוד של EPN. מגוון רחב של כלים זמין ויכול לשמש לאיסוף דגימות קרקע ובם: מקלפות אדמה, כפות סיידים, חופרי הודעה חור, מקדחים, צינורות דגימה, אתים שני, בין השאר (איור 2).
בהתאם לצורך של המחקר, יכולות להיחשב שתי אסטרטגיות דגימה:) מרובדת, ב) דגימה אקראית (איור 3). הדגימה מרובדת משמשת בדרך כלל כחלק מלימוד אינטנסיבי באזור מסוים או demarked על פני תקופה נתונה של זמן. באופן כללי, חתך הוא demarked ודגימות קרקע נלקחות במרווחי זמן קבועים בחתך על פני תקופה של זמן (איור 3 א) 15. הדגימה האקראית היא בדרך כלל מועסק כאשר מתמקדים באזור נרחב. אסטרטגיית דגימה זו הייתה בשימוש ללימוד המגוון של EPN וrom שטח גדול גיאוגרפי או באזור (איור 3 ב) 12. מספר גורמים יכולים להיחשב בהתאם למיקוד של המחקר הכולל מגוון רחב של גבהים, מרקמי קרקע ובתי גידול (לדוגמא., שדות מעובדים, יערות, שטחי מרעה, פארקים, חופי ים, אזורי riparian, וכו ').
אנחנו מראים את הטכניקה מתגרה חרקים, שתוארה במקור על ידי מצעים ו1 Akhurst ומהווה חלופה פשוטה וסלקטיבית לשחזור EPN מדגימות קרקע. זהו הליך סלקטיבית המבוסס על ההנחה כי נמטודות (שלב IJ) יימשך למארח חרקים וparasitize זה. טכניקה זו יכולה להיחשב גם לבידוד של פתוגנים אחרים חרקים כגון פטריות, חיידקים ו8,10.
אנחנו גם מדגימים את טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת לאחזור צאצאי נמטודות ממארחי חרקים נגועים 7,14. זה מאמץ נפגשהוד שמציע את היתרון של אחזור נמטודות צאצאים "נקיים" ללא פסולת מגוויות חרקים משפילות.
לבסוף, הטכניקות המתוארות ומוצגות במאמר זה מתאימות לאלה שהגו ו / או שבוצעו במעבדה שלנו, כמו גם אלה שתוארו על ידי עמיתים ומשתפי פעולה שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפגנה זו היא הראשונה מבין שתי מצגות המתארות את מספר הטכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד EPN והחיידקים סימביוטיים שלהם. טכניקות אלו מייצגות שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN במעבדה וגם יוצרות את הבסיס למבדקים אחרים שמעסיקים EPN כמו אורגניזמים מודל למחקר.
<p class="jove…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לחברים בעבר במעבדה המלאי: סם-קיו קים, קתרין Plichta וויקטוריה מירנדה-תומפסון על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. אנו מכירים את תמיכת הקרן הלאומית למדע (מענקי IOS-0,840,932 וIOS-0,724,978) לבורסת SP.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | for insect baiting technique |
| Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc Plastic Bags | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Mechanical Pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | infection chamber and White trap assembly |
| pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
| Sodium Hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | soil sampling , desisnfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | N/A | soil sampling |
| Soil Probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
Referencias
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. . The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. , 473-488 (2007).
- Gaugler, R. . Entomopathogenic Nematology. , (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
- Kaya, H. K., Stock, S. P. . Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. . Manual of techniques in invertebrate pathology. , (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. . Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J., Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. , 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R. Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes. Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
