أخذ العينات التربة والنيماتودا الممرضة للحشرات عزل (Steinernematidae، Heterorhabditidae)
Summary
النيماتودا الممرضة للحشرات هي الديدان الإسطوانية-تقطن التربة التي تتطفل مجموعة واسعة من الحشرات. ونحن لشرح طرق أخذ العينات المستخدمة لعزل هذه النيماتودا من التربة باستخدام اثنين من التقنيات: والاصطياد والحشرات فخ الأبيض تعديل، لاسترداد الديدان الخيطية من عينات التربة والحشرات الجثث المصابة، على التوالي.
Abstract
النيماتودا الممرضة للحشرات (الملقب EPN) تمثل مجموعة من الديدان الخيطية، التي تقطن التربة التي تتطفل مجموعة واسعة من الحشرات. هذه الديدان الخيطية تنتمي إلى عائلتين: Steinernematidae وHeterorhabditidae. حتى الآن، وقد وصفت أكثر من 70 نوعا في Steinernematidae وهناك حوالي 20 نوعا في Heterorhabditidae. النيماتودا دينا شراكة متبادلة مع البكتيريا المعوية ومعا بمثابة مجمع الحشرات القوية التي تقتل مجموعة واسعة من أنواع الحشرات.
هنا، ونحن نركز على تقنيات تعتبر الأكثر شيوعا لجمع EPN من التربة. الجزء الثاني من هذا العرض يركز على تقنية الاصطياد الحشرات، وهو النهج المتبع على نطاق واسع لعزل EPN من عينات التربة، وتعديل فخ الأبيض الأسلوب الذي يستخدم لاسترداد هذه الديدان الخيطية من الحشرات المصابة. هذه الأساليب والتقنيات هي الخطوات الرئيسية لإنشاء الناجح لEPN عبادةالقوام في المختبر وأيضا تشكل الأساس لاختبارات بيولوجية الأخرى التي تنظر في هذه النيماتودا كما الكائنات نموذج للبحوث في التخصصات البيولوجية الأخرى. التقنيات المعروضة في هذا العرض تتوافق مع تلك التي يؤديها و / أو تضعها أعضاء SP المختبر المالية فضلا عن تلك التي وصفها العديد من الكتاب.
Introduction
وترتبط العديد من الديدان الخيطية مع الحشرات، وتتراوح التفاعلات التي تستضيفهم من المفيد أن يضر. هنا، ونحن نركز على مجموعة من الديدان الخيطية التي هي مسببات الأمراض من الحشرات، المعروف أيضا باسم الديدان الخيطية الممرضة للحشرات (أو EPN). الديدان الخيطية عائلتين ينتمون إلى هذه المجموعة من الديدان الخيطية: Steinernematidae وHeterorhabditidae 11،13. تأثير المسببة للأمراض التي هي في الواقع التي يمنحها تفاعلها مع البكتيريا اللاهوائية الاختيارية المعوي (البكتيريا Xenorhabdus اقترانه steinernematids والبكتيريا Photorhabdus اقترانه heterorhabditids) 2. وتنقلها البكتيريا من المضيف الحشرات إلى آخر عن طريق المرحلة الخيطية حرة المعيشة فقط، والأحداث المعدية المرحلة الثالثة (المعروف أيضا باسم الأحداث داور، الأحداث المعدية أو IJ)، التي تعيش في التربة. مرة واحدة داخل الحشرة، والديدان الخيطية الافراج عن البكتيريا في الدملمف الحشرة التي تقتل الحشرات المضيف عن طريق تسمم الدم واسعة النطاق. البكتيريا أيضاتتحلل الأنسجة الحشرة وتصبح مصدر الغذاء النيماتودا "، والسماح لهم حتى تنضج وتتكاثر. عادة، يتم إنتاج واحد أو جيلين من الديدان الخيطية الكبار داخل جيفة الحشرات. ذرية من الجيل الكبار reassociates مشاركة مع عدد قليل من الخلايا البكتيرية في أكثر متخصصون بطريقة من العلاقة السابقة الغذائية الخاصة بهم، ورعاية هذه الخلايا في الأمعاء لأنها الخروج من الذبيحة الحشرات في التربة حيث أنها سوف تنتظر الحشرات آخر لتتطفل 6،11،14 (الشكل 1).
منذ اكتشافه في عام 1927، وقد نظرت EPN بدائل المبيدات الكيميائية قيمة لأنها يمكن أن تتطفل مجموعة واسعة من الحشرات التي هي الآفات الزراعية 3،4،5. ومع ذلك، على مدى العقدين الماضيين، وقد تم التعرف على هذه الديدان الخيطية والبكتيريا التكافلية التي كنظام نموذج مرن لدراسة الجوانب البيولوجية والإيكولوجية والتطورية المضيف ميكروب interactioنانوثانية 14.
الهدف من هذا العرض هو إظهار الأساليب والتقنيات المستخدمة الأكثر شيوعا لعينات التربة وعزل EPN. مجموعة متنوعة من الأدوات متاحة ويمكن استخدامها لجمع عينات من التربة بما في ذلك: معدات استخراج عينات جوفية التربة، والمسجات، حفارات آخر ثقب، بريمة، وأنابيب أخذ العينات، معاول جهة، من بين أمور أخرى (الشكل 2).
اعتمادا على الغرض من الدراسة، واستراتيجيات أخذ العينات اثنين يمكن اعتبار: أ) الطبقية، ب) أخذ العينات العشوائية (الشكل 3). عادة ما يتم استخدام العينة الطبقية كجزء من دراسة مكثفة في منطقة معينة أو demarked على مدى فترة معينة من الزمن. بشكل عام، يتم demarked على القطع وتؤخذ عينات من التربة على فترات المنصوص عليها في القطع على مدى فترة من الزمن (الشكل 3A) 15. واستخدمت العينة العشوائية عموما عندما تركز على منطقة واسعة. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية أخذ العينات لدراسة تنوع EPN وROM منطقة جغرافية واسعة أو المنطقة (الشكل 3B) 12. ويمكن النظر في عدد من العوامل اعتمادا على التركيز في الدراسة بما في ذلك مجموعة متنوعة من المرتفعات، والقوام التربة والموائل (مثل.، الحقول المزروعة والغابات والمراعي والحدائق، والشواطئ، والمناطق المتشاطئة، الخ).
نقدم لك مجموعة من تقنية الاصطياد الحشرات، التي وصفت في الأصل من قبل الفراش وAkhurst 1 ويمثل بديلا بسيطة وانتقائية لاسترداد EPN من عينات التربة. هذا هو إجراء انتقائي يقوم على فرضية أن الديدان الخيطية (المرحلة IJ) سوف ينجذب إلى مضيف الحشرات وتتطفل عليه. ويمكن أيضا أن تعتبر هذه التقنية لعزل مسببات الأمراض الأخرى مثل الحشرات والفطريات، والبكتيريا 8،10.
نحن أيضا تدليل على تعديل فخ الأبيض الأسلوب الذي يستخدم لاسترجاع الديدان الخيطية ذرية من المضيفين الحشرات المصابة 7،14. هذا هو جهد التقىهود التي توفر ميزة استرجاع على 'نظيفة' الخيطية ذرية خالية من الحطام من جثث الحشرات المهينة.
وأخيرا، فإن التقنيات الموضحة والمبينة في هذه المادة تتوافق مع تلك تصور و / أو أجريت في مختبرنا وكذلك تلك التي وصفها العديد من الزملاء والمتعاونين.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه التظاهرة هي الأولى من عرضين التي تصف عددا من التقنيات التي تستخدم عادة لدراسة EPN والبكتيريا التكافلية بهم. هذه التقنيات تمثل الخطوات الرئيسية لإنشاء ناجحة الثقافات EPN في المختبر وتشكل أيضا الأساس لاختبارات بيولوجية أخرى التي توظف EPN كما الكائنات نموذج للبحوث.
<…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر أعضاء الماضية من مختبر الشركة: سام كيو كيم، كاثرين Plichta وفيكتوريا ميراندا طومسون لمساهماتها في تحسين العديد من هذه البروتوكولات. نعترف دعم مؤسسة العلوم الوطنية (منح IOS-0840932-0724978 وIOS) لSP المالية.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | for insect baiting technique |
| Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc Plastic Bags | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Mechanical Pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | infection chamber and White trap assembly |
| pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
| Sodium Hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling , desisnfecting |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | soil sampling , desisnfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | N/A | soil sampling |
| Soil Probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | N/A | soil sampling |
| tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
Referencias
- Bedding, R. A., Akhurst, R. J. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica. 21, 109-110 (1975).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. . The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. , 473-488 (2007).
- Gaugler, R. . Entomopathogenic Nematology. , (2002).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , (1990).
- Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
- Kaya, H. K., Stock, S. P. . Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
- Lacey, L. A. . Manual of techniques in invertebrate pathology. , (2012).
- McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae). Biological Control. 19, 182-190 (2000).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).
- Poinar, G. O. . Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , 23-61 (1990).
- Stock, S. P., Gress, J. C. Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona. Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).
- Stock, S. P., Hunt, D. J., Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. Nematode morphology and systematics. Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. , 3-43 (2005).
- Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
- Stuart, R. J., Gaugler, R. Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes. Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
