A interferência RNA larval no Red Flour Beetle,<em> Tribolium castaneum</em

1 T. Ações castaneum e cultivando Decidir sobre um T. castaneum tensão a ser usado para o experimento. NOTA: Vários T. estabelecida em laboratório cepas castaneum estão disponíveis. Ga-1 (Georgia-1) é a cepa parental de Ga-2, que foi usado para a sequenciação do genoma 3. Desde Ga-1 partes maioria dos polimorfismos de DNA (como polimorfismos de nucleotídeo único, SNPs) com Ga-2, e é mais saudável do Ga-2 devido ao menor endogamia, é ideal para experimentos de RNAi. Pu-11 é outra estirpe conveniente de usar , como o próprio amarelo proteína fluorescente (EYFP) maior expressão única no futuro primórdios ala nos permite distinguir o último estágio larval de outros estádios (veja a Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2.013 12). É importante documentar que tensão besouro foi utilizado no experimento, como origens genéticas parecem significativamente affect o RNAi fenótipos 13. Prepare T. castaneum farinha cultura pela adição de 5% (em peso) de levedura de cerveja pré-peneirado para orgânica farinha de trigo integral (após mistura, armazenar a farinha de cultura à temperatura de -20 ° C). Alíquota da farinha de cultura (à temperatura ambiente) em garrafas de plástico de 6 onças banco de Drosophila (cerca de 40 g / frasco). Cultura T. castaneum a 30 ° C com 70% de humidade. Use uma incubadora com humidade controlada, se possível. Adicionar 30-40 adultos por frasco de cultura (relação homem: mulher 1: 1) para iniciar a cultura. NOTA: Apesar de molde raramente é um problema a 30 ° C, temperaturas mais baixas (por exemplo, 25 ° C), com 70% de umidade pode causar o crescimento de fungos na cultura farinha. Abaixe a umidade se isso ocorrer. Transfira os adultos para um novo frasco de cultura a cada duas semanas para a repicagem (veja o passo 5,2-5,5 para saber como isolar adultos a partir de farinha de cultura). NOTA: Demora cerca de três semanas para obter a última larvas. Alternatvamente, T. castaneum culturas podem ser mantidas a uma temperatura mais baixa (2.025 ° C), embora com um período mais longo a cultura (tempo de desenvolvimento a 25 ° C é aproximadamente o dobro que a 30 ° C). 2: Preparação de soluções e instrumentos para larval injeção dsRNA Sintetizar moléculas de dsRNA homólogas ao gene alvo por transcrição in vitro. Armazenar a -80 ° C. Veja Philip e Tomoyasu 2011 11 para os procedimentos de biologia molecular detalhadas. Ver também a discussão para um número de parâmetros que devem ser considerados no projeto de moléculas de dsRNA. Adicione 10 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C) por mistura de 8,5 ml de 1 M de Na 2 HPO 4 com 1,5 ml de 1 M NaH 2 PO 4. Verificar o pH com um medidor de pH e ajustar em conformidade. Adicione 1 ml de 10x tampão de injecção através da mistura de 10 mL de tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M de KCl, 100 ul de corante alimentar verde e 790 ul de água bidestilada (ddH2O). Diluir o tampão 10x injecção para perfazer 2x tampão de injecção (200 ul de tampão de injecção 10x + 800 ul ddH2O). Armazenar ambos 10x e injecção 2x tampões a 4 ° C até ser necessário. Prepare Fixo lâminas de vidro. Cubra toda uma lâmina de vidro com uma forma de cola reposicionável para injeções de larvas. Para adultos ou pupa injeções, fazer duas tiras finas de cola ao longo das mais longas bordas do slide. Deixe a cola secar por vários dias, o que garante que a cola permanece brega o suficiente para aderir besouros para o slide, ao mesmo tempo, permanecendo flexível o suficiente para facilitar a sua remoção após a injeção. NOTA: Se a cola fica muito pegajoso, use um dedo e toque na cola, o que reduzirá a aderência. Cada slide pode conter até 40 ou 50 besouros, e pode ser reutilizado até que ele não consegue controlar com segurança os animais. Alterntivamente, fita de dupla face pode também ser usado, embora a fita adesiva, por vezes não é suficiente para manter as larvas. Faça uma cesta de eterização. Retirar o êmbolo de uma seringa descartável de 10 ml, a seringa e cortar ao meio em torno da linha 6 ml. Descartar a metade inferior da seringa. Resumidamente aquecer a superfície de corte da parte superior da seringa, com um queimador de gás, e empurrar rapidamente o plástico derretido sobre um pedaço de malha de nylon para colar a malha na seringa. Apare qualquer excesso de malha, uma vez que o plástico endurece. Prepare o frasco éter. Adicionar 30 ml de éter a uma boca estreita de 100 ou 250 ml frasco de vidro. Adicionar várias peças de papel de seda para aumentar a evaporação do éter. NOTA: Ether apresenta um risco de incêndio e também é prejudicial. Sempre lidar com éter sob uma coifa. Feche bem a tampa quando não estiver em uso. NOTA: O gelo pode ser utilizado como uma alternativa mais segura (tal como, num ambiente de sala de aula), embora o sedation é menos eficaz. 3 Preparação de larval Injeção Aparelho Coloque numa fase mecânica XY em um microscópio de dissecação. NOTA: estágios XY mecânico estão disponíveis a partir de grandes empresas de microscópio. Em alternativa, as fases de microscópio de baixo custo pode ser utilizado para a maioria dos microscópios de dissecação com algumas modificações (ver tabela de materiais, por exemplo). Coloque um manipulador mecânico agulha perto do palco mecânica XY. Montar uma seringa de injeção. Use uma torneira de quatro vias (com ligações Luer) para conectar uma seringa descartável de 30 ml para um suporte de agulha de vidro, permitindo a manipulação da seringa de injecção, sem afectar a pressão no interior da agulha de injecção (ver Philip e Tomoyasu 2011 11 para a seringa de injecção detalhada montagem). 4. Puxando as agulhas de injecção Puxe agulhas de vidro de borosilicato (B100-50-15, OD: 1 milímetro, ID: 0.5 mm, 15 centímetros de comprimento) por umpuxador de agulha. NOTA: Para Sutter P-87 ou P-97, use a configuração "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90" ou seguir o Capítulo 2 da pipeta Cookbook: células aderentes, C. elegans, Drosophila, e peixe-zebra – programas recomendados. As configurações ideais variam de acordo com o modelo do puxador da agulha. A configuração para um genérico Drosophila agulha de injeção é um bom ponto de partida. Loja puxado agulhas em uma caixa de plástico (por exemplo, uma caixa de CD de plástico) e prenda com removível massa de montagem. 5 Isolamento e Seleção de Larvas Coloque uma peneira # 25 em um receptor peneira. Inserir o conteúdo do frasco de cultura (besouros da farinha e cultura) na peneira, e peneirar o conteúdo imediatamente. Não deixe o conteúdo da peneira sem peneirar, como larvas rapidamente tentar cavar através da peneira e ficar preso. Agressivamente filtrar o conteúdo para deixar cair farinhaatravés de e deixar larvas mais velhas (normalmente 6 ° e 7 ° larvas), pupas e adultos (juntamente com suas cutículas elenco-off, exúvias) por trás em cima da peneira. Transferir os materiais remanescentes no peneiro (escaravelhos e Exúvia) para a panela de sementes. Continue a tocar a panela para evitar que os besouros de escapar. Remover o Exúvia e as restantes partículas de farinha na superfície dos besouros por soprando suavemente sobre o tabuleiro de sementes. Toque a panela de sementes para mover o conteúdo para o fundo da panela. Então, deixe a panela inexplorado por alguns segundos. Aguarde até que os adultos, que são mais móveis do que outras etapas, a sair da pilha. Remover adultos utilizando um pincel de arte (por exemplo, largura de 1 cm). Pupas separado batendo suavemente o tabuleiro de sementes, mantendo a boca da panela um pouco para baixo, como pupas tendem a rolar mais rápido em direção à boca. Utilização de um pincel para remover as pupas, deixando apenas as larvas na panela de sementes. Plás larvas isolado em um prato limpo Petri. Selecione um grau adequado de larvas para injecção e os coloque em um prato separado Petri. NOTA: larvas última precoce (1-2 dias após a muda larval final) são muitas vezes adequado ao analisar o efeito RNAi em morfologias adultos, bem como sobre a metamorfose. É, no entanto, por vezes, necessário para realizar ARNi no penúltimo (ou mesmo antes) fase para avaliar a função do gene precoce (por exemplo, as Figuras 3E-3H. Também ver Clark-Hachtel et al. 2,013 12). Use pupas como referência de tamanho para identificar o estádio de larvas. A última larvas são um pouco mais longo do que pupas. Alternativamente, pu-11 pode ser usada para identificar a última larvas, bem como para determinar o período de tempo do desenvolvimento de larvas no último instar (Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2,013 12). Mantenha as larvas selecionado em uma placa de Petri até eterização. Coloque o restode larvas e outros estágios de besouros (como pupas e adultos) de volta em um frasco de cultura com farinha e devolvê-lo para a incubadora. 6 Preparação de agulhas de injeção Coloque uma agulha de vidro previamente puxou para uma lâmina de vidro usando pegajoso ou fita dupla face. Utilizando uma pinça, testar o tirou da agulha ao olhar através do microscópio de dissecação para ver onde as curvas de ponta. Agarre a área um pouco para o lado da ponta de onde as curvas da agulha com o fórceps e torcer para quebrar. Manter bons agulhas e descartar outros. Considere-se uma boa agulha como tendo uma abertura que não é nem muito grande nem muito pequena (cerca de 0,05 mm de diâmetro. Figuras 1A e 1B), e é inclinada para fazer a penetração da cutícula larval mais fácil (Figuras 1B e 2A-2B). Considere-se um mau agulha como (i) muito pequena, fazendo com que a absorção de uma solução de ARNcd na agulha dificulto (etapa 7) (Figuras 1D e 2D), (ii) muito grande, causando lesão de larvas e letalidade possível após a injecção (Figuras 1C e 2F), (iii) sem corte, tornando a penetração da cutícula lesão difícil e crescente. Insira a agulha no porta-agulhas. Primeiro, desaparafusar a ponta do suporte de agulha e colocar a extremidade posterior da agulha para a ponta da titular. Em seguida, colocar a junta de borracha sob a ponta de suporte (pelo menos 1 cm a partir da extremidade posterior da agulha de vidro). Inserir a parte de trás da agulha no suporte, com a junta de borracha totalmente inserida na abertura do suporte de agulha. Parafuso da ponta de volta para o titular. Colocar o suporte da agulha montada sobre a agulha manipulador. Manter o suporte de agulha perto da horizontal. Ajustar a posição do manipulador, de modo que a ponta da agulha está localizado no centro da vista quando se olha através do microscope. 7 Solução de pré-alimentação dsRNA na agulha Preparar a solução de injecção de ARNcd a apenas antes da injecção, através do ajuste da concentração com ddH2O e misturando a solução com volumes iguais de ARNcd de 2x tampão de injecção (passo 2.3). Manter a solução mista no gelo. Veja a discussão sobre a concentração de dsRNA. Cortar a ponta de uma pipeta de 20 uL ponta descartável. Pipetar 10 ml da solução para dentro da ponta da pipeta aparado. Remova cuidadosamente a ponta da pipeta da pipeta, mantendo o líquido na ponta, fornecendo contrapressão. Alternativamente, remover cuidadosamente a ponta e, em seguida, passar a solução para a extremidade da ponta, proporcionando pressão utilizando um dedo. Colocar a ponta da pipeta com a solução de ARNcd na platina do microscópio usando pegajoso com a abertura virada para a ponta da agulha. Olhando através do microscópio, mova lentamente a ponta carregado em direção à agulha até a ponta doagulha é apenas dentro da ponta da pipeta e carregada para dentro da solução. Ao olhar através do microscópio, puxe o êmbolo da seringa para puxar lentamente a solução dsRNA na agulha. NOTA: Não sobrecarregue a agulha. À medida que a extremidade de a solução se aproxima da dsRNA ponta da agulha, diminuir a taxa de puxar e parar de carregar a solução antes de a ponta da agulha atinja ar. Se o ar atinge a ponta, a solução será rapidamente arrastada para o suporte de agulha, o que resulta em graves problemas de contaminação. Procedimentos de limpeza detalhadas de suporte da agulha são descritas em Philip e Tomoyasu 11, 2011. Retirar a pressão de injecção da seringa e suporte de agulha pela abertura da torneira. Em seguida, move a ponta da pipeta para longe da ponta da agulha. Levante a agulha para cima do palco para evitar acidentalmente danificar a agulha ao colocar as larvas no palco. Remover a ponta da pipeta a partir da fase de esvaziado. </ol> 8 injeção dsRNA Coloque as larvas no cesto eterização. Use menos de 10 larvas se aprender a técnica. Use 30-40 larvas em uma rodada, uma vez confortável com a técnica. Coloque a cesta com larvas na garrafa éter e feche a tampa. NOTA: Ether apresenta um risco de incêndio e também é prejudicial. Execute esta etapa sob uma coifa. Larvas Etherize durante cerca de 3 min. Confira as larvas para o movimento depois de 3 min. Colocá-los de volta na garrafa éter por 30 seg, se eles ainda estão se movendo. Não Etherize por mais de 5 minutos, pois isso pode aumentar a letalidade. NOTA: O tempo de eterização ideal pode variar dependendo da temperatura e umidade. Transferir as larvas anestesiado do cesto para a borda antiaderente de uma lâmina de vidro pegajoso. Utilizando uma pinça e ao olhar através do microscópio, pegar cada um larvas por um e colocá-los para o slide. Lay-los lateralmente e bata suavemente para baixo seus corpos from cabeça e cauda, ​​com a pinça, um pouco de alongamento-los como você vai, para se certificar de que eles são garantidos para o slide. Coloque o slide pegajoso com larvas no palco microscópio. Insira a agulha carregada dsRNA suavemente para o lado dorsal das larvas para evitar danos ao sistema nervoso central. Evite também a linha média dorsal, como o coração larval está localizado aqui. Nesta e nas subsequentes etapas, usar sempre a fase de mover-se as larvas para a agulha (em vez de utilizar o manipulador de agulhas para mover a agulha). NOTA: O local de injecção específica não importa como RNAi em T. castaneum parece ser sistêmica. No entanto, é geralmente mais fácil de injectar no lado dorsal dos segmentos torácico ou abdominal. Após a inserção da agulha no larvas, puxar a agulha ligeiramente para trás para permitir espaço para o dsRNA de entrar na cavidade do corpo de larvas. Empurre a seringa de injecção até que as larvas vez verde (ou a cor do tampão de injecção) e procurar stretched e completo. NOTA: Se aprender a técnica, tentar injetar o máximo possível para determinar a quantidade de solução que pode ser injetado em uma larva, sem letalidade significativa. Ela é geralmente de cerca de 0,5-0,7 uL. Retirar a agulha do larvas. Ao remover a agulha, ligeiramente puxe a seringa de injeção para evitar perda de dsRNA (também tomar cuidado para não puxar o ar). Injetar todas as larvas no slide. Certifique-se de remover as larvas que não foram injetadas com sucesso. Injeção completa antes larvas acordar (em cerca de 10 min). Remover o diapositivo com larvas injectadas no microscópio de injecção e deixar a lâmina durante mais 5 min, até que todas as larvas se recuperar da eterização. Com fórceps e sob um microscópio de dissecação, levantar delicadamente as larvas da cabeça à cauda para liberá-los a partir do slide pegajosa. Coloque as larvas recém-lançado em um prato limpo Petri. Deixar as larvas na placa de Petri durante 10-15 minutos para permitir a injecção wound a coagular. Coloque as larvas para um novo frasco com farinha e limpo etiqueta adequada incluindo o nome da estirpe, o tipo de dsRNA injectado, a concentração de dsRNA, o número de larvas injectadas, e a data. Cultura das larvas injectadas a 30 ° C com 70% de humidade. Observe as larvas para RNAi fenótipos regularmente. NOTA: A última empupam larvas dentro de 7 dias. Em seguida, as pupas vai EFeche em adultos após 7 dias (se não houver nenhuma anormalidade no momento causado por RNAi). 9 Confirmação de Knockdown e fenotípicas análises Considerar a avaliação da eficiência de RNAi derrubar por várias técnicas de biologia molecular, tais como diferentes quantitativa de transcrição reversa-PCR (qRT-PCR) e Western Blotting. Veja Miller et al. 7, 2012 e Philip e Tomoyasu 2011 11 para qPCR detalhada e Western Blot protocolo, respectivamente. Analisar RNAi fenótipos relacionados. NOTA: RNAi relacionadofenótipos podem ser observadas em vários estágios diferentes e sob diferentes condições de cultura, de acordo com os genes que foram alvo. RNAi pode afectar a morfologia do besouro, metamorfose, fisiologia e comportamento. Como muitas vezes a presença do fenótipo é verificada e em que condições os besouros são criados devem ser adaptados às questões específicas a ser investigado através de RNAi.