Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites ^1, as células estaminais miog�icas ^2,3. In vivo, estas células existir num estado quiescente reversivelmente localizado entre o sarcolema e lâmina basal de cada myofibre, mas tornar-se activado para proliferar, fusível e diferenciar como o tecido muscular danificado, reparado e regenerado ^3. Células satélite pode ser isolado a partir de amostras de biópsia jovens e idosos músculo humano utilizando digestão enzimática ⁴ e suas propriedades pode ser subsequentemente miog�icas estudado em cultura primária ^5. A eficiência deste processo de isolamento em conta tanto o rendimento e a pureza da população celular depende dos métodos utilizados e podem variar de amostra para amostra. Os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são as células satélites (células miogénicas agora denominadas células precursoras ou músculo), inicialmente identificadas como células CD56 ⁺ / desmina, e mufibroblastos derivados de LECSA, identificadas como CD56 ^– e TE7 ^{+ 5} células. Os fibroblastos têm uma taxa de proliferação rápida e não sejam submetidos a parada do crescimento irreversível e diferenciação terminal em cima do contato célula-célula, como as células miogênicas; assim, em populações mistas, os fibroblastos podem invadida células miogênicas a dominar a cultura.

Os fibroblastos têm sido muitas vezes visto como uma irritação para os biólogos musculares, no entanto, agora há um interesse crescente em fibroblastos como células dignos de estudo em seu próprio direito, nomeadamente no que eles foram mostrados para ter um papel de cooperação com células miogênicas durante a reparação muscular ⁶ . O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de ambos os tipos de células em cultura. Activada por fluorescência de células (FACS) é um método pelo qual as células podem ser classificadas para estudo adicional e / ou contados eanalisado. FACS tem sido demonstrado de forma fiável para enriquecer células miogénicas humanos, mas o rendimento de células para cultura posterior, até agora não tem tido grande ^7. Dado o potencial de replicação limitado de células somáticas, tais como células derivadas de células-satélite Miogênicos e os muito pobres proliferação e diferenciação associados à senescência ^4, abordagens mais suaves são obrigatórios. Culturas de fibras musculares individuais oferecem uma outra, menos agressivo, os meios de obtenção de células satélites murino ainda residente em seu nicho sublaminal e após a sua ativação em cultura ^8,9. No entanto, isso muitas vezes não é possível a partir de material da biópsia do músculo humano (porque as fibras raramente pode ser obtido a partir de tendão para tendão) o que significa que esta técnica pode não ser acessível a muitos laboratórios de pesquisa interessados ​​em estudar as células derivadas de músculos humanos. Além disso, a técnica de uma única fibra apenas fornece o número de células muito limitadas.

Aqui nós descrevemos um sistema de triagem com base no gendigestão enzimática tle de células utilizando colagenase e dispase seguido por duas rondas sucessivas de triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e rendimento (2,8 x 10 ~ ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ células / g de tecido) para experimentos em cultura. CD56 é considerado o marcador de superfície padrão de ouro para a identificação de células satélites humanos in situ e in vitro ^{10 11} e proporciona o marcador de superfície candidato ideal para a fixação do grânulo. Nesta abordagem, os anticorpos CD56 conjugado com óxido de ferro superparamagnético e grânulos contendo polissacáridos estão ligados às células e passado através de uma coluna de separação de células magnético de gradiente elevado colocada num campo magnético forte ^12,13. As colunas de separação são cheios com uma matriz de lã de aço ou de ferro ferromagnéticos esferas que servem para concentrar as linhas de campo magnético para a sua superfície gerar fortes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) ¹⁴. Nestas colunas mesmo células ligeiramente magnéticas são atraídas e adsorvido à sua superfície ^14. Unbound (CD56 ^-) células passam através da coluna enquanto que as células CD56 ⁺ marcadas com microesferas magnéticas são mantidos até a retirada do campo magnético ^12,15.

As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada a uma densidade desejada para posterior experimentação. Após um determinado intervenção os constituintes celulares podem ser identificados usando imunocitoquímica, fotografada usando de campo amplo ou microscopia de fluorescência confocal e analisados ​​quantitativamente usando uma abordagem de análise de imagem que permite a rápida medição objectivo de todas as células marcadas em qualquer imagem. Em nosso laboratório temos usado essa abordagem triagem imunomagn�ica duplo seguido por análise de imagem ¹⁶ para demonstrar que CD56 ^– fibroblastos humanos prontamente transdiferenciam em adipócitos, enquanto célula miogênicas de origem satélite são altamente resistentes a esta conversão adipogênica ^5.