Мозга миелоидных клеток характеристика следующие инсульта может быть выполнена стереологии с использованием метода оптического ректификационной колонны, или с помощью проточной цитометрии анализа мозга лейкоциты суспензии. Оба полезные методы, чтобы выполнить точную фенотипическое различие основных миелоидных подмножеств клеток, найденных в ишемической мозга.
Активация микроглии, а также экстравазация кроветворных макрофагов и нейтрофилов, как полагают, играет ключевую роль в черепно-мозговой травмой после инсульта. Эти миелоидной субпопуляции клеток могут отображать различные фенотипы и функции и должны быть выделены и охарактеризованы изучить их регулирования и вклад в повреждение тканей. Этот протокол обеспечивает два различных методологий для мозга иммунной характеристик клеток: точное стереологической подход и анализ проточной цитометрии. Стереологический подход основан на методе ректификационной оптической, которая вычисляет общее количество клеток в области интереса (инфаркта мозга) оценивается путем систематического случайного отбора. Второй подход характеристика обеспечивает простой способ, чтобы изолировать мозг лейкоцитов суспензий и охарактеризовать их с помощью проточной цитометрии, позволяющий для характеристики микроглии, проникли моноциты и нейтрофилы ишемической ткани. Кроме того, он также дetails мозговой модель ишемии у мышей, что исключительно влияет коры головного мозга, создавая высокую воспроизводимость инфаркты с низким уровнем смертности, а также порядок гистологической обработки мозга, чтобы охарактеризовать объем инфаркта методом Кавальери.
Морфологические, фенотипические и экспрессии генов изменения микроглии, а также кровоизлияние и активация кроветворных макрофагов и нейтрофилов, как полагают, играют ключевую роль в патофизиологических каскада после травмы головного мозга 1-4. Этот протокол обеспечивает два подхода для оценки количества различных миелоидный клеток подмножеств ишемической мозга и выполняют свою фенотипическую характеристику. Кроме того, он также предоставляет описание экспериментальной модели ишемии головного мозга у мышей, которая состоит из переходного или постоянной перевязкой как дистальной средней мозговой артерии (СМА) и общей сонной артерии (ОСА), в том числе, как оценивать инфаркт по точным методом Кавальери, используя стереологической программного обеспечения.
Первый подход, чтобы охарактеризовать миелоидных клеток подмножества ишемического мозга стереологического метод, основанный на ректификационной подход оптического 5. Это наиболееобычно используется стереологической зонд в области наук о жизни и обеспечивает высокую степень точности, с низким коэффициентом ошибок 5-7. Это лучший выбор для мобильного количественного когда ткань разрезают на отрезки, как это позволяет избежать предвзятости оценки клеток из-за фрагментации ткани в разделах. Этот метод является очень мощным средством для характеристики номера, динамику и фенотипические изменения проникли нейтрофилов субпопуляций ишемического ткани 8.
Второй подход характеристика основана на модифицированной протокола от Кампанеллы и соавторов 9, что обеспечивает простой способ, чтобы изолировать мозга лейкоцитов суспензий и охарактеризовать их с помощью проточной цитометрии. В отличие от обычных иммуногистохимических методов, проточной цитометрии характеристика позволяет дифференцировать микроглии (CD45 ло CD11b +) и проникли миелоидных клеток (CD45 Привет CD11b +) в зависимости от их разлУровни экспрессии отличны от CD45 9-13. Кроме того, про-воспалительных моноциты (CD45 привет CD11b + Ly-6G – Ly-6C привет), нейтрофилы (CD45 привет CD11b + Ly-6G +) и другие лейкоциты подмножества ишемической ткани можно выделить. Этот подход обеспечивает надежный и быстрый анализ, чтобы оценить нейровоспаления в экспериментальных моделях ишемии головного мозга. Однако, обработка ткани может влиять на состояние активации и численность различных клеточных популяций, найденных в ишемической ткани, обеспечивающей полу-количественных характеристик.
Церебральный модель ишемии представленные здесь дает очень воспроизводимые объемы инфаркта определяются через 24-48 ч и 7 дней после MCA лигирование различных подходов 8,15,17. Эта модель MCAO имеет низкая смертность (менее 1%) по сравнению с другими, сводя к минимуму количество животных, используемых в исследованиях. Важным шагом для получения этого низкий уровень смертности является поддержание надлежащих условий асептики, чтобы избежать инфекций, которые могут ухудшить выживания после индукции инсульта. Эта модель MCAO не может быть использован только в качестве постоянного модели MCAO, который считается клинически значимых модель для трансляционных исследований 18, но и в качестве временной модели транзиторной перевязки ОСО и MCA с удавкой и задней реперфузии в нужное время 19. Этот метод был успешно использован для мышей и крыс 17,20. Все это свидетельства того, что MCAO перевязкой является высокая универсальная модель церебральной ишемии с несколькими приложениями. Critiкал шаг этого метода является то, что он требует инвазивной хирургии под стереомикроскопом; краниотомия должна быть выполнена очень тщательно, чтобы не повредить скуловой кости, а также MCA. Тем не менее, использование фиктивных животных (которые подвергаются хирургической процедуры, но ОСО и MCA лигирования не выполняется) обеспечивает полезный инструмент для различения хирургической процедуры в зависимости от эффекта. Степень повреждения головного мозга Следуя этой технологии может быть определена количественно несколькими способами. Наш протокол мозга секционирование, прокрашивание Нисслю и последующей оценки объема Кавальери позволяет точного количественного определения поврежденной области и сводит к минимуму количество мышей, используемых в этом типе исследований, поскольку участки последовательного мозга также может быть использован для различных иммуногистохимического анализа. Для лучшего выполнения этой методологии, важно, чтобы выбрать соответствующие параметры, используемые в программном обеспечении стереологии (Таблица 1), которые будут необходимы для оценки йе объем различных регионах по формуле: V = 1 / SSF * F * T * Ер я (SSF является выборочная доля ломтик, Т средняя толщина секций, F является площадь шагом сетки и Ер количество точек, попадающих на структуру).
Дистальный MCAO перевязкой могут быть полезны для характеристики проникли лейкоцитов и клеток субпопуляции иммунных 8,13, что участие в воспалительном процессе после повреждения головного мозга 1-4. Здесь мы предлагаем две различные методики для мозга иммунных клеток характеристики, точного стереологического подхода и анализа проточной цитометрии для более подробной характеристики несколько лейкоциты субпопуляции.
Воспользовавшись серийным срезов головного мозга, количественное определение общего числа нейтрофилов может быть достигнуто с помощью метода оптической ректификационной 16, который оценивает общее количество клеток с количеством клеток пробы остроумиега Систематическое случайной выборки (SRS) набор объективных виртуальных подсчета пространств, охватывающих всю интересующую нас область, в нашем случае область инфаркта, с равномерным расстоянием между объективными виртуальных Подсчет пробелов в направлениях X, Y и Z. Этот метод обеспечивает точный инструмент для оценки общего числа нейтрофилов в ишемических мозга в разное время после перевязки. Хотя это не показано в данном исследовании, этот протокол также может быть использован для оценки различных субпопуляций нейтрофилов после ишемии и 21 для точного количественного определения любой другой клеточной популяции, найденной в ишемической мозга, как и другие проникли лейкоцитов (моноциты / макрофаги) а также для оценки выживших нейронов или даже нейрогенез количественного после инсульта. Самый важный шаг для точной оценки в необходимой области Выбор соответствующих параметров, как те, показано в таблице 3 для нейтрофилов количественного в зоне ишемии.Эти параметры будут использоваться для обеспечения стереологии рассчитать общее количество позитивных клеток (N) с помощью уравнения N = ΣQ- х 1 / SSF х 1 / ASF х 1 / TSF (ΣQ- является общее количество подсчитанных клеток с ректификационной колонны, SSF является раздел выборки фракция, ASF является пробная площадь фракция, и ФБО толщина доля выборки) 5. Хотя эта методика медленнее, чем другие методы количественного (например, анализ нейтрофилов маркеров на мг ткани, денситометрия представительных изображений или числа нейтрофилов в поле зрения), он имеет преимущество, чтобы быть беспристрастным и прочную технику, которая обеспечивает точное количественная оценка количества клеток.
Подход выделение мозга лейкоцитов позволяет одновременно идентификации и количественной оценки нескольких подтипов иммунных клеток без необходимости смещения системы окрашиванием в естественных или генетических манипуляций. После сортировки клеток от характеризуется миелоидной рopulations или их иммуномагнитный разделение может быть использован для нескольких последующих приложений, таких как дальнейших исследований по гена или экспрессии белка. Точную характеристику нейтрофилы, моноциты и микроглии получены с помощью этого метода обеспечивает высокую специфичность по отношению к существующим методам, таким как иммуногистохимических исследований, то преимущество, что позволяет выделить специфические функции в различных миелоидных клеток, которые обеспечивают мозг врожденного иммунного ответа. Кроме того, она может быть дополнительно расширен, чтобы характеризовать других групп мозга с соответствующей меткой, как кровь родилась макрофагов (CD11b + CD45 + CD68 Привет), и он может быть применен для изучения других патологий ЦНС или травмы. Поэтому этот метод обеспечивает необходимый инструмент для изучения неоднородности воспалительной реакции в мозге. Основным ограничением этого метода заключается в подготовке лейкоцитов суспензий из свежих мозговой ткани, которые могут изменитьсостояние активации клеток или их антиген изменения. Хотя этот метод позволяет более подробно качественную характеристику по сравнению с иммуногистохимических исследований, она обеспечивает более точную количественную оценку, основанную на выделении клеток. Несмотря на это, эффективность нашего протокола изолятор похож на других опубликованных методов 9, и он может быть эффективно использован для определения различий в количестве иммунных клеток головного мозга между контролем и MCAO групп или даже между MCAO групп, подвергнутых различных обработок 8.
Основные этапы этого протокола рассечения тканей, процедура разрушение ткани, и удаление миелина. Что касается коллекции тканей, шаг нормализации могут быть включены (путем взвешивания ткани, собранной), чтобы избежать изменчивости в связи с различными рассечение выступлений. Кроме того, нормализация между различными группами MCAO также может происходить через объем инфаркта (ранее определяется магнитной Resonance). Другой способ решения этой проблемы заключается в использовании всей ипсилатерального полушария обоих ишемических и контрольных групп, или даже использовать контралатерального полушария ишемического мыши в качестве контроля, чтобы свести к минимуму количество животных, используемых. Хотя такой подход позволяет избежать различий между каждой вскрытия, он имеет главный недостаток; коэффициент разбавления добавляется за счет увеличения общего количества клеток, но не количество миелоидных клеток, которые исключительно расположенных в основных и пригородных инфаркта областях ипсилатеральном мозга. Что касается разрушение ткани, этот протокол иллюстрирует шаги для механического разрушения клеток головного мозга, избегая ферментативные методы лечения и предотвращения поверхностного антигена изменения 9,22, что является важным вопросом для дальнейшего качественного и количественного анализа воспалительных клеток субпопуляций. В дополнение к подготовке клеточной суспензии интереса, удаление миелина из образцов мозга является настоятельно рекомендуется шаг, чтобы избежать помех downstполосный приложения, такие как разделение иммуномагнитной клеток или проточной цитометрии 23,24. Это может быть достигнуто с использованием различных методов, например сахароза или Перколла градиенты, или анти-миелина шарики. Вот и на основе предыдущих исследований, сравнивающих различные методы выделения подвески клеток головного мозга, механическое разрушение в сочетании с использованием Перколла удалить миелина используется для повышения урожайности клеток и жизнеспособность 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |