脳卒中後の脳骨髄細胞の特徴づけは、光分留法を用いて、立体解析によって行う、または脳白血球懸濁液のフローサイトメトリー分析により得ることができる。両方は、虚血性脳に見出さ主骨髄細胞サブセットの正確な表現型の区別を行うために有用な技術である。
ミクログリアの活性化、ならびに血行性マクロファージおよび好中球の血管外遊出は、脳卒中後の脳損傷において極めて重要な役割を果たしていると考えられている。これらの骨髄性細胞亜集団は、異なる表現型および機能を表示し、区別する必要があり、組織損傷に対する規制や寄与を研究するために特徴付けられることができる。正確な立体的アプローチとフローサイトメトリー分析:このプロトコルは、脳の免疫細胞の特性評価のための2つの異なる方法を提供します。立体的なアプローチは、系統的ランダムサンプリングによって推定関心領域内のセルの総数(脳梗塞)を算出する光学分留法に基づいている。第二の特徴付けアプローチは、虚血組織の単球および好中球が浸潤し、ミクログリアの特徴付けを可能にする、脳白血球懸濁液を単離し、フローサイトメトリーによってそれらを特徴付けるために簡単な方法を提供する。さらに、それはまた、dは死亡率の低さ、およびカバリエリ法により梗塞体積を特徴づける学的脳処理の手順で再現性の高い梗塞を生成する、もっぱら脳皮質に影響を与えたマウスにおける脳虚血モデルをetails。
形態学、表現型および遺伝子発現ミクログリアの変化、ならびに血管外遊出及び血行性マクロファージおよび好中球の活性化は、脳損傷1-4以下の病態生理学的カスケードに重要な役割を果たしていると考えられている。このプロトコルは、虚血性脳の異なる骨髄細胞サブセットの数を推定するために、それらの表現型の特徴付けを行うために2つのアプローチを提供する。さらに、それはまた、梗塞を評価する方法を含む、両方の遠位の中大脳動脈(MCA)の一時的または永久的な連結および総頸動脈(CCA)で構成されたマウスにおける脳虚血の実験モデルの説明を提供する立体解析ソフトウェアを使用して、正確なカバリエリ法による。
虚血性脳の骨髄細胞サブセットを特徴付けるための最初のアプローチは、光精留塔のアプローチ5に基づいて、立体的な方法である。これは、最もあり一般的に生命科学の立体解析プローブを使用し、エラー5-7の低い係数の高精度を提供します。それが原因のセクションへの組織の断片化の細胞推定上のバイアスを避けるように組織が、セクションに切断されたときにこれは、細胞定量化のための最良の選択である。この方法は、数字、ダイナミクスと虚血組織8の浸潤した好中球の亜集団の表現型の変化を特徴づけるために非常に強力な方法です。
第二の特徴付けアプローチは、脳白血球懸濁液を分離するために、フローサイトメトリーによってそれらを特徴付けるための簡単な方法を提供カンパネラおよび共同研究9から修正されたプロトコルに基づいている。従来の免疫組織化学法とは対照的に、特徴付けフローサイトメトリミクログリアの間(CD45 見よのCD11b +)を微分可能にし、それらの差分に基づいて、骨髄細胞(CD45 ハイのCD11b +)の浸潤CD45 9-13のerent発現レベル。また、炎症促進性単球(CD45 ハイのCD11b + Lyと-6G – Lyの-6C ハイ )、虚血組織の好中球(CD45 ハイのCD11b + Lyと-6G +)及び他の白血球サブセットを区別することができる。このアプローチは、脳虚血の実験モデルにおいて神経炎症を評価するための信頼性が高く、迅速なアッセイを提供する。しかし、組織の処理は、半定量的な特徴付けを提供する虚血組織に見られる異なる細胞集団の活性化状態と数字に影響を与えることができる。
ここで紹介する脳虚血モデルは、再現性の高い梗塞ボリュームは24〜48時間と異なるアプローチ8,15,17によるMCAの結紮後7日を決定します。このMCAOモデルは、研究で使用された動物の数を最小限に、他と比較して低い死亡率(1%未満)を有する。死亡率のこの低い速度を得るための重要なステップは、卒中誘導後の生存を損なう可能性の感染を避けるために、適切な無菌状態を維持することである。このMCAOモデルができるだけでなく、翻訳の研究18の臨床関連モデルと考えられている永久MCAOモデルとして使用されるだけでなく、スリップノットと後部再灌流とCCAとMCAの一過性のライゲーションによる一過性モデルのような所望の時点で19。この方法は、正常にマウスおよびラット17,20で使用されている。このすべての証拠は、連結によるMCAOは、複数のアプリケーションとの脳虚血の高い汎用性モデルであることを示している。 critiこの技術の校正ステップは、実体顕微鏡下に侵襲的手術を必要とすることである。開頭術は頬骨だけでなく、MCAを損傷しないように、非常に慎重に行われるべきである。しかし、(手術手順に供されるが、CCAとMCA結紮を行わない)偽動物の使用は、外科的処置依存効果を識別するための便利なツールを提供します。この技術は、次の脳損傷の程度は、いくつかの方法によって定量することができる。脳切片、ニッスル染色およびカバリエリによるボリュームの後続の推定の我々のプロトコルは、損傷領域の正確な定量を可能にし、連続脳切片は、異なる免疫組織化学的分析のために使用することができるので、研究のこのタイプに使用されるマウスの数を最小化する。この方法論のパフォーマンスを向上させるために、それは目を推定するために必要となる立体学ソフトウェア( 表1)で使用される適切なパラメータを選択することが重要ですの式により、異なる領域の電子容積:V = 1 / SSFは、* のf *トン*のΣPiが (Ssfをtは切片の平均厚さは、スライスサンプリング画分で、fは格子間隔の領域であり、 ΣP構造に当たる点の数)。
ライゲーションによる遠位MCAOは浸潤白血球および免疫細胞の亜集団脳損傷1-4以下の炎症プロセスに関与8,13を特徴付けるために有用であることができる。ここでは、脳の免疫細胞の特徴付け、正確な立体的アプローチより優れ複数の白血球亜集団を特徴付けるためのフローサイトメトリー分析のための2つの異なる方法を提案する。
連続脳切片を利用して、好中球の総数の定量化は、細胞サンプリング機知の数から細胞の総数を推定する光分留法16によって達成することができるhaの体系的なランダム方向X、YとZの公平な仮想カウント空間の間の一定の間隔でこのメソッドは、に正確なツールを提供し、我々の場合梗塞領域における関心領域全体をカバーする公平な仮想カウントスペースの(SRS)のセットを、サンプリング結紮後の異なる時点での虚血性脳における総好中球数を推定する。それは、本研究で示されていないが、このプロトコルは、虚血21後および他浸潤白血球(単球/マクロファージ)のような虚血性脳で検出された他の細胞集団の正確な定量化のための別の好中球の亜集団を推定するためにも使用することができるまた、生き残った神経細胞を推定するための、さらには脳卒中後の神経新生の定量化のために。ものは、虚血領域における好中球の定量化のために、表3に示すように、所望の領域における正確な推定のための最も重要なステップは、適切なパラメータの選択である。これらのパラメータは、(ΣQ-を用いて計数した細胞の総数N =ΣQ-×1 / SSF×1 / ASFの×1 / TSFの式を用いて、総陽性細胞数(N)を計算するために立体学ソフトウェアのために使用される精留塔は、SSFはASFのサンプリング画領域であり、TSFはサンプリング分の厚さ)5である、節サンプリング率である。この方法は、他の定量化技術よりも遅いものの(例えば、組織、代表的な画像またはフィールド当りの好中球の数の濃度測定の投与による好中球マーカーの分析)は、それが公平かつ正確に提供する固体技法であるという利点を有している細胞数の定量化。
脳白血球分離法は、 インビボでの染色または遺伝子操作することによって、システムのバイアスを必要とすることなく、いくつかの免疫細胞のサブタイプの同時同定及び定量を可能にする。特徴と骨髄Pからソーティングその後の細胞opulationsまたはそれらの免疫磁気分離は、遺伝子又はタンパク質発現に対するさらなる研究のような複数の下流の用途に使用することができる。この方法で得られた好中球、単球及びミクログリアの正確な特性は、免疫組織化学的研究は、脳の先天性免疫応答を媒介する別の骨髄細胞に特定の機能を割り当てることができます利点として、既存の方法に対して高い特異性を提供する。加えて、さらに血液由来マクロファージ(のCD11b + CD45 ハイ CD68 +)のような、適切なラベルと他の脳集団を特徴づけるために拡張することができ、それは、他のCNS 病理または傷害を研究するために適用することができる。したがって、この技術は、脳内の炎症反応の不均一性を探求するために不可欠なツールを提供しています。この技術の主な制限は、変更することができ、新鮮な脳組織から白血球懸濁液の調製に常駐細胞の活性化状態またはそれらの抗原変質。この技術は、免疫組織化学的研究に比べてより詳細な定性的な特性評価を可能にするが、それは細胞の単離に基づいて、より少ない正確な定量を提供しています。それにもかかわらず、我々の細胞単離プロトコルの効率は、他の公開された方法論9と同様であり、それは効率的に制御し、MCAO群の間、あるいは異なる処理8を施しMCAOグループ間の脳の免疫細胞の数の差を検出するために使用することができる。
このプロトコルの重要なステップは、組織切開、組織破壊手順、およびミエリンの除去である。組織収集に関しては、正規化ステップは、異なる解剖性能に起因するばらつきを回避するために、(採取した組織を秤量することによって)を含めることができる。さらに、異なるMCAOグループ間の正規化はまた、梗塞容積を介して起こり得る(以前磁気Rによって決定esonance)。この問題を解決する別の方法は、両方の虚血性群と対照群の全同側半球を使用し、あるいは使用される動物の数を最小化するための対照として、虚血マウスの対側半球を使用することである。このアプローチは、各解剖の違いを回避するが、それは主な欠点を有する。希釈係数は、細胞の総数排他的ではないが、同側皮質のコアおよび梗塞周囲の領域に位置している骨髄細胞の数を増加させることによって付加される。組織破壊に関しては、このプロトコルは、酵素処理を回避し、表面抗原変質9,22、炎症性細胞亜集団の更なる定性的および定量的分析のための必須の問題を防止し、脳細胞の機械的破壊のためのステップを示す図である。目的の細胞懸濁液の調製に加えて、脳試料からミエリン除去downstとの干渉を避けるために非常に推奨されるステップであるそのような免疫細胞分離などの連アプリケーション、またはフローサイトメトリー23,24を流れる。これは、異なる方法、例えば、スクロースまたはパーコール勾配、または抗ミエリンビーズを用いて達成することができる。ここで、および脳細胞懸濁液を単離するための異なる方法を比較した以前の研究に基づいて、ミエリンを除去するパーコールの使用と組み合わせて、機械的な破壊は、細胞収量および生存率25を改善するために使用される。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |