JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Неинвазивного Модель Neuropathogenic<em> Кишечная палочка</em> Инфекция в новорожденной крысы

Published: October 29, 2014
doi:
10.3791/52018
, , , ,
1School of Pharmacy,University College London, 2Mucin Biology Group,University of Gothenburg

Summary

Здесь процедура описана для установления системной инфекции в неонатальном крысы с культурами кишечной палочки K1. Это неинвазивная процедура позволяет колонизации желудочно-кишечного тракта, перемещение возбудителя в большой круг кровообращения, а вторжение в центральной нервной системе при сосудистого сплетения.

Abstract

Исследование взаимодействия между хозяином животного и бактериального возбудителя имеет смысл только, если инфекция модель используется повторяет основные черты естественного заражения. Этот протокол описывает процедуры для разработки и оценки системной инфекции из-за neuropathogenic кишечной палочки K1 в неонатальном крысы. Колонизация желудочно-кишечного тракта приводит к распространению возбудителя вдоль кишки лимфатических гематоэнцефалический ходе инфекции и модель показывает сильную зависимость возраста. Штамм E. палочка О18: K1 с повышенной вирулентностью для новорожденных крыс производит исключительно высокие темпы колонизации, перемещение в отсеке крови и вторжения в мозговых оболочек следующим транзитом через сосудистого сплетения. Как и в организме человека, проникновение центральной нервной системы сопровождается местное воспаление и неизменно летальным исходом. Модель подтвержденной полезности для изучения механизмапатогенеза, для оценки терапевтического вмешательства и для оценки бактериальной вирулентности.

Introduction

Системные бактериальные инфекции является серьезной угрозой для благополучия и выживания новорожденных; недоношенных детей особенно уязвимы. Неонатальный бактериальный менингит (НБМ), часто связан с бактериальным сепсисом, по-прежнему остается значительным источником заболеваемости и смертности в течение первых нескольких недель жизни, и проблема усугубляется продолжающейся эволюции устойчивости к фронтовых антибактериальных препаратов 1,2. Случай НБМ является неотложной медицинской помощи, что несет в себе высокий медицинскую, социальную и экономическую нагрузку 3; следовательно, существует настоятельная потребность в новых терапевтических и, в частности, новых профилактических стратегий для снижения бремени инфекций. Некоторые особенности НБМ необычны: в развитых странах мира, кишечная палочка и группа B стрептококков отвечают за подавляющем большинстве случаев и способность этих штаммов чтобы выявить НБМ почти всегда связано с наличием защитного полисахарида окpsule что позволяет возбудителя уклониться иммунную признание обрабатывает 4. Очень высокий процент (80 – 85%) Нейроинвазивные Е. палочка выразить K1 капсулу 5,6, в α-2,8-сшитый полимер полисиаловая кислоты, которая структурно идентичен пройдет модуляторы нейронной пластичности 7.

Оценка новых терапевтических и профилактических для НБМ и связанного бактериемии и сепсиса явно выиграло бы от крепкого животной модели инфекции, которая имитирует основные черты этой болезни в человеческом новорожденных, в частности сильного возрастной зависимости и естественным путем инфекции , Широкий ассортимент моделей для грамположительных и грамотрицательных бактерий менингита доступны 8,9 и это значительно расширили наши знания о патогенезе, патофизиологии и лечения вариантов в этих инфекций. Таким образом, экспериментальные инфекции в крыс, мышей, кроликов и обезьян были использованы для изучения менингит как в пeonate и взрослых. Тем не менее, многие из этих моделей используют прямой интрацистернального или подкожную инъекцию бактерий для инициации инфекции, создавая искусственный патогенез, минуя естественные процессы распространения от места колонизации. В некоторых случаях эти методы прививки привели к значительным изменениям в патологии; например, подкожное введение Е. Штаммы палочка K1 аннулировал возрастной зависимости, связанное с естественной инфекции, производя бактериемии и вторжение в центральной нервной системе (ЦНС) в обоих новорожденных и взрослых 10. Предрасположенность к Е. палочка НБМ критически зависит от вертикальной передачи возбудителя от матери к ребенку при или сразу после рождения 11. По материнской линии происхождения Е. палочка K1 бактерии колонизируют новорожденных желудочно тракта (ЖКТ) 11-13, который является стерильным при рождении, но быстро приобретает сложную микробиоту 14. В колонизированных новорожденных, Е. палочкаK1 бактерии обладают способностью перемещать из просвета кишечника в системный кровоток перед входом в ЦНС через гематоэнцефалический или кроваво-спинномозговой жидкости барьеров 9,15. Конструкция мощных моделях экспериментального заражения должны принять эти детали во внимание.

Хотя мыши широко используются для изучения некоторых форм бактериального менингита 8, они непригодны для исследований неонатальной инфекции: они перегружены системной инфекции и не показывают сильную характеристику возраст зависимостей человеческих младенцев 16. Кроме того, α-дефензины, ключевые пептиды желудочно-кишечного тракта, обеспечивающего защиту от системного вторжения Е. палочка K1 17, высоко выражена в Paneth клеток и нейтрофилов в организме человека и крыс, но не у мышей 18. Существует замечательный степень дублирования, резервирования и неоднородности в мыши дефенсина и смежных cryptidin генов не обнаружено в другомimals 19. Неонатальный крыса изначально использовался Моксон и сотрудниками 20 для расследования патогенез гемофильной инфекции менингита после интраназального заражения, тиражирование естественную сайт колонизации этой новорожденных возбудителя в организме человека, а затем адаптированы для возрастного Е. палочка K1 бактериемия и менингит. Bortolussi др. 21 занятые внутрибрюшинно инъекции бактериального инокулята для инфицирования, но ключ изучение Glode и сотрудниками 22 использовали оральные кормления желудка в параллельные естественный путь заражения Г.И. колонизации. Как желудочный зонд может привести к повреждению слизистых поверхностей, процедура была усовершенствована, чтобы включить подачу посевного материала для новорожденных 23. В данном случае способ для GI колонизации и процедур для отслеживания инфекции у восприимчивых крысят описанных путей; Кроме того, обсуждаются терапевтические и профилактические приложения модели.

Protocol

Все эксперименты на животных, проведенные в этом исследовании соответствовали национальным и европейским законодательством и утверждены Комитетом по этике в UCL школы фармакологии и Министерство внутренних дел Великобритании (HO) по. Все животные работа велась в рамках проекта HO лицензии PPL 80/2243 и PPL 70/7773. 1. Крыса Подготовка Выполняйте все эксперименты в крысах с патоген-бесплатно Wistar новорожденных крыс. Сохраните все крысы пометов (12 новорожденных на колонии) в отдельных клетках с их кормящих мам (9 – 11-недельных самок), при оптимальных условиях (19 – 21 ° C, 45 – 55% влажности, 15 – 20 воздушных изменения / ч и 12 ч цикл свет / темнота). 2. бактериальная клетка Подготовка Магазин Е. палочка K1 запасы в 20% (об / об) глицерина при -80 ° С. Для каждого эксперимента, пластины из запаса бактерий на Мюллера-Хинтона (MH) чашках с агаром, и инкубируют при 37 ° CO / N. Накануне подачи, inocuКонец 10 мл MH бульоне с одной Е. палочка К1 колонии и культура O / N при 37 ° С, 200 оборотов в минуту. В качестве контроля для среднего загрязнения, подготовить 10 мл незасеянной MH бульона и инкубируют при 37 ° C при 200 оборотах в минуту. Передача 100 мкл O / N бактериальной суспензии в 9,9 мл MH бульона (1: 100 об / об), и инкубируют при 37 ° С, 200 оборотов в минуту, до середины экспоненциальной фазы не будет достигнуто, соответствующая оптической плотности 0,6 измеряли при длине волны 600 нм (OD 600). 3. Кормление новорожденных крыс с Е. палочка K1 Придерживая животное вертикально в одной руке от шиворот, позволяя рот открыть. Аккуратно вставьте стерильной пипетки в рот животного, и пипетка 20 мкл инокулята (~ 37 ° C) в рот животного над период времени с 30 сек. Вернуться животное к его матери сразу после кормления. Убедитесь, что 4 – 8 х 10 6 бактерий кормили тO друг щенок путем серийного разведения инокулята в PBS и пятнистость на чашках с агаром MH. 4. Оценка колонизации E. палочка K1 Придерживая животное одной рукой от шиворот. Смочите стерильную ватным тампоном в стерильной PBS, а затем аккуратно протрите перианальной области. Вернуться животное к его матери сразу после моечные. Поместите кончик тампона в пробирку, содержащую 300 мкл стерильной PBS и хранить на льду. Определить количество жизнеспособных бактерий путем серийного разведения в PBS и покрытие на чашках с агаром MacConkey. Определить жизнеспособной Е. палочка K1 бактериофага тестирования на чувствительность. Подберите индивидуальную колонию, используя стерильный микробиологической петли, погружают в 200 мкл стерильной PBS, то с учетом вихревого смешивания. С помощью стерильной микробиологической петли, субкультуру на агаре МН по прямой линии. Разрешить пластина высохнуть в течение 30 сек, а затем пипеткой 10 мкл BACteriophage K1E (10 9 бляшкообразующих единиц / мл (БОЕ / мл)) на центре линии. Инкубируйте планшет O / N при 37 ° С. На следующий день, изучить пластину для бактериофага опосредованного лизиса. 5. Оценка тяжести заболевания Оценить тяжесть заболевания каждого животного 4 – 5 раз в день с помощью семи пунктов балльной системы, описанной в таблице 1. Если баллы животных ≥3 из 7, сразу же отобрать животное, чтобы минимизировать страдания. Запишите животное как мертвый. 6. Euthanization из новорожденных крыс и сбора крови Придерживая животное одной рукой, подвергая голову и шею. Лечить шею животного, протирая тампоном, смоченным спиртом. Дезинфекцию большой ножницы с использованием 70% этанола, до промывки в стерильной PBS, чтобы удалить этанол трассировки. Придерживая животное прямо над чашке Петри. Обезглавьте новорожденного, используя острый Surgiские ножницы, гарантируя, что кровь капает в чашку Петри. Избегать контакта с головы, чтобы предотвратить загрязнение крови с кожной флоры. Сразу собирают кровь с помощью стерильной пипетки и смешать с солью гепарина натрия в концентрации 20 – 50 ед / мл в 0,5 мл микроцентрифужных трубки. Определить количество жизнеспособных бактерий путем серийного разведения в PBS и покрытие на чашках с агаром MacConkey. Определить количество жизнеспособных Е. палочка K1 путем тестирования восприимчивость жизнеспособных бактерий в бактериофага K1E. 7. Вскрытие После обезглавливания новорожденных крыс, использовать асептических условий для вырезания и собирать тканей интерес. Вымойте все инструменты (показанные на рисунке 1) в 70% -ном этаноле и стерильной PBS. Очистите рассечение доска и смачивать живот полностью с 70% этанола. Расположите труп на спину и закрепите на рассечение борту (I) возлагает левую заднюю ногу кТаблица операции стерильной иглой, (II) растяжения труп и закрепления правую переднюю ногу на операционном столе, (III) пиннинга правую заднюю ногу и левую переднюю ногу на операционном столе. Потяните кожу вдоль левой стороны внизу живота, используя пинцет, то разрезать вдоль левой стороны трупа от нижней части живота к грудине, используя маленькие ножницы рассечение. Расширить иссечение всей грудины, а затем вниз по правой стороне трупа от грудины до нижней части живота с помощью щипцов и маленькие ножницы рассечение, гарантируя, что ни одна из базовых структур не повреждены. Наконец, осторожно потяните вниз кожный лоскут от грудины до нижней части живота с помощью IRIS изогнутые рассечение пинцет, чтобы разоблачить брюшины. Аккуратно поднимите брюшины с пинцетом и сократить вертикально выставить внутренние органы, убедившись, что ни один из основных органов не повреждены. 8. СборЖелудочно-кишечный тракт Определить желудок, тонкий кишечник, слепую кишку, толстой кишки и брыжеечных лимфатической системы. Снимите живот, осторожно, пересекающих в обе стороны, а затем поместите в Бижу, содержащей 1,6 мл стерильного PBS с помощью стерильного пинцета. Разреза толстой кишки в прямую кишку. Осторожно потяните всю кишечную массу от трупа, используя рассечение пинцет и место в стерильную чашку Петри. Убедитесь, что это будет сделано аккуратно, так что кишечная структура и брыжеечные лимфатические структуры не разделять. 9. Разделение желудочно-кишечного тракта и брыжеечных лимфатической системы (Рисунок 2) Налейте 30 мл стерильного PBS в чашке Петри, обеспечивая ЖКТ полностью погружен. Определите центральную массу брыжеечной лимфатической системы, и зажать с помощью тонких рассечение пинцет. Определить наиболее проксимальной части тонкой кишки, и зажать с помощью тонких рассечение пинцет. Медленно вытяните Centraл масса брыжеечной лимфатическую систему и дистальной тонкой кишки в противоположных направлениях, пока два тканей полностью отделены друг от друга. Выполнение этого процесса с осторожностью, чтобы гарантировать, что тонкий кишечник не растягивается, так как это предотвращает воспроизводимый коллекцию проксимальной, средней и дистальной регионов. Поместите брыжеечной лимфатическую систему в 300 – 500 мкл стерильной PBS и разместить на льду. 10. Секционирование ЖКТ Разреза на желудочно-кишечный тракт в слепой кишке, чтобы отделить тонкую кишку из толстой кишки. Поставьте двоеточие 300 – 500 мкл стерильной PBS и разместить на льду. Сбор репрезентативных ткани от проксимальных, средних и дистальных отделах тонкой кишки. Совместите тонкий кишечник от средней точки. Затем (I) собирают последние 2 см ткани до слепой кишки в качестве дистальной тонкой кишки, (II) сбора ткани, из 5 – 7 см от средней точки, как в проксимальном отделе тонкой кишки, и(III) сбора ткани, из 3 – 5 см ниже средней точки, как Ближний тонкой кишки. 11. Сбор Печень Определить три лопасти печени крыс после удаления желудка. Потяните лепестки от брюшной полости с использованием тонких рассечение пинцет. Снимите печень, сокращая любые крепления связок, используя тонких ножниц. Поместите печень в 300 – 500 мкл стерильной PBS и место на льду. 12. Сбор Селезенку Определить селезенку. Потяните селезенки от желудка и использовать тонкие ножницы, чтобы вырезать gastrosplenic связки. Поместите селезенки в 300 – 500 мкл стерильной PBS и место на льду. 13. Сбор почек Определить почки, которые станут видимыми в задней части брюшной полости после удаления из желудочно-кишечного тракта и других органов. Cut мочеточники и любые присоединение связки Uпеть тонких ножниц рассечение и удалить почки с помощью тонких щипцов. Удалить надпочечники и любой жирный материал (если еще прилагается), используя тонкий пинцет и рассечение ножницами. Положите обе почки в 300-500 мкл стерильной PBS и разместить на льду. 14. Сбор мозг После обезглавливания, держать голову в вертикальном положении с помощью изогнутых щипцов. Зажмите кожу на верхней части головы в продольном направлении с помощью другого набора изогнутых щипцов, и сделать надрез, используя тонких ножниц рассечение. Вырезать оставшуюся кожу около шеи, снова продольно с тонких ножниц рассечение. Потяните кожу в наружу направлении, используя тонкий пинцет с обеих сторон, чтобы выявить череп и удалить кожные лоскуты с помощью тонких ножниц рассечение. Поместите тонких ножниц рассечение в спинном открытия и сделать надрез вдоль черепа к трибуне. Вытяните обе части черепа в наружу направлении, используя тонкий пинцет. Вырезать, чтобы удалить сегменты черепа. <lя> Удалить мозг с помощью широких щипцов, используя вверх черпая движение от спинного открытия к трибуне. Вымойте мозг в PBS в два раза, чтобы удалить кровь из процедуры обезглавливания. 15. Ткань Обработка и усреднении Для экспериментов, требующих жизнеспособности рассчитывает или извлечение ДНК, место ткани в пробирки, содержащие стерильный PBS. Сразу определить число жизнеспособных бактерий путем серийного разведения в PBS и покрытие на чашках с агаром MacConkey, или хранить при -20 ° С с 20% глицерином в течение короткого срока. Для выделения ДНК, магазин тканей при -20 ° C. Для экспериментов, требующих экстракции РНК, место ткани в соответствующих объемах раствора RNAlater (10 мкл на 1 мг ткани), затем хранить сразу же при -20 ° С в течение короткого периода времени или при -80 ° C длительного хранения. Для экспериментов, требующих обработки изображений, место тканей в 10 мл раствора Methacarn (60% метанол, 30% хлороформа и 10% уксусной кислоты), а затем сохранитьт RT (20 – 25 ° C) в течение 3 недель. Рассчитать вес ткани путем сравнения веса трубок до и после добавления тканей. Однородный тканей с использованием гомогенизатора. Промыть гомогенизатора один раз в 70% этаноле и дважды в стерильном PBS между гомогенизации каждого образца. Примечание: Methacarn фиксация является желательным для фиксации кишечных образцов с целью сохранения муцина, связанных слизистой оборонных структур; формалин фиксации могут быть использованы для системных тканей.

Representative Results

Е. палочка K1 системная инфекция модель описана здесь повторяет многие черты естественного заражения в организме человека. Бактерии внутрь, колонизировать желудочно-кишечный тракт, перемещать в отсек крови через брыжеечных лимфатических узлов, прежде чем создать орган по конкретным заболеванием с соответствующим воспаление мозга 24. Важно отметить, что эта модель показывает сильную зависимость возраста; как показано на рисунке 3, два-дневные (P2) крысята сильно подвержены инвазивных заболеваний, но в течение семидневного периода животные становятся все более невосприимчивой к инфекции, но не Г.И. колонизации тракта 17. После транзита от места GI колонизации в отсеке крови, бактерии могут быть визуализированы в образцах крови с помощью флуоресцентной микроскопии (рис 4) перед входом в ЦНС преимущественно в сосудистое сплетение 25. У некоторых животных, существует обширное вторжение в других основных органов, таких каклегких, селезенки и почек 25. Количество бактерий в ткани может существенно варьироваться в зависимости от индивидуальных щенков 25, но при бионагрузка оценивается как наличие или отсутствие таких существует высокая степень воспроизводимости в отношении органов вторжения. С помете 12 щенков, как одной тестовой группе, расчеты электростанции, использующие G * Питание Программное обеспечение установлено, что это размер выборки равняется 98,6% вероятности нахождения эффект, основанный на выживание, используя шесть животных из когорты и> 99% вероятностью, если все в двенадцать учтены. Модель поэтому подходит для оценки новых препаратов, специально разработанных для лечения бактериальных инфекций у новорожденных и был использован в процедуре оценки терапевтического потенциала капсулы depolymerase EndoE, которые селективно удал ет капсулу K1 от бактериальной поверхности 24-26. Он также может быть использован для исследования хозяин-бактерии взаимодействий, которые влияют на похлопываниеhogenesis Е. палочки neuropathogens; в этом контексте она была использована для исследований Е. палочка A192PP колонизация и распространение. Было показано, что E. палочка A192PP клетки сохраняются в желудочно-кишечном тракте P2, P5 и Р9 щенков в больших количествах; временные аспекты колонизации в этих трех группах были очень похожи (Рисунок 5) и отражает способность бактерий к размножению и поддерживать плотность населения в пределах кишечнике. Вирулентность клинических изол A192 была повышена путем серийного пассажа в новорожденных крыс с тем чтобы обеспечить мало или вообще не избыточность использования животных. Е. палочка A192 колонизировали P2 новорожденных крыс с 100% эффективностью, вызвало бактериемию в 35% животных и произвел смертельный эффект в 25% 27. Пассировать производная A192PP колонизирует желудочно-кишечный тракт, вызывает бактериемии и вызывает летальность во всех P2 щенков. Таким образом, модель может быть использована, чтобы исследовать вирулентность диразличны х К1 напрягает по отношению к их способности, чтобы вторгнуться в ЦНС и других органов и систем с сайта колонизации. В этом контексте, Pluschke и сотрудники 23 использовали новорожденных модель крысы инфекции для определения потенциала 95 E. палочка K1 напрягает человеческого происхождения, чтобы вызвать бактериемию после кишечной колонизации; они наблюдали значительные различия в эффективности обоих колонизации и инвазивного потенциала, лежащие в основе клонального природу E. палочка K1 neuropathogens. Рисунок 1. Материалы для коллекции тканей: (A) весы, (B) предварительно взвешивают трубы, содержащие необходимые носители, (C) операционный стол, линейка и иглы придавить животное, (D) 70% (v / v) этанол и PBS стерилизовать сбора ткани оборудования, <sТронг> (Е) сбор тканей комплект включая большое ножницами для декапитации и ножниц и пинцетов и лопастей различного размера и формы, (F) со льдом, чтобы сохранить ткани, (G), 70% (об / об) этанола для стерилизации Таблица операции и окружает. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Разделение желудочно-кишечного тракта и брыжеечных лимфатической системы. (A) Возьмитесь за центральную масса брыжеечной лимфатической системы с мелкими рассечение щипцов. (B) Возьмитесь за проксимальная часть тонкой кишки, и тянуть в разные стороны. (C) желудочно-кишечного тракта и брыжеечных лимфатическая система будет полностью separatе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Выживаемость новорожденных крысят в возрасте от двух дней (Р2) на девять дней (P9) после перорального введения E. палочка A192PP, иллюстрирующий сильный возраста зависимость системной инфекции. Каждая группа представляет 24 новорожденных. Рисунок 4. Флуоресцентные изображения из E. палочка A192PP клетки в мазке крови от P2 щенка инфицированных после перорального введения бактерий. Антиген липополисахаридный O на поверхности бактерий была улained с кроличьей анти-O18 поликлональных антител и Alexa546-конъюгированного козьего анти-кроличьего второго антитела. Капсула K1 визуализировали с EndoE-GFP реагента. Практически все бактерии, обнаруженные в пробах крови отображается защитный K1 капсулу. Изображения были получены доктором Андреа Zelmer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5. Е. палочка A192PP кишечного колонизации после введения бактериального инокулята. ДНК экстрагируют из цельной кишечника и Е. палочка К1 колониеобразующих единиц / г (КОЕ / г) ткани определяется количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) ориентированные на polysialyltransferase (Neus) ген, как описано в другом месте 17 </suр>. LOD: предел обнаружения. Особенность Здоровый Нездоровый Цвет кожи Розовый Бледный / Желтый Ловкость (рефлекса) Щенок сразу сменить на обратной размещения Сложность в изменении обратную размещение (> 3 сек) или не может достичь Нежный давление на живот Нет звука Звук агитации Желудок / молокопровод Видимое и белый Не видно Температура Теплый Относительно холодно * Вес Прирост 1,5-2 г в день Нет увеличение веса или потеря веса Поведение при размещении в клетке Шаги в направлении матери и начинает пeeding Не можете двигаться к матери и показывает трудности кормления Таблица 1. Семь-точка система подсчета очков: Первые три оценки, перечисленные, как правило, первые признаки, наблюдаемые. * Новорожденные с системной инфекции опыт повышенной температуре тела (> 2 ° C). Тем не менее, из-за отсутствия ловкостью животных, чтобы достичь своей матери для поддержания температуры тела, нездоровые животные могут отделиться от помета и холодно к голой рукой.

Discussion

Модель животное описано здесь основывается на предыдущей работе, целью воспроизвести характерные черты естественных инфекции в организме человека. Новорожденных крыс были изначально использованы для изучения младенческой менингита, вызванного H. гриппа типа B, как виды удовлетворены основные критерии для надежной модели инфекции. Таким образом, портал вступления соответствующего возбудителя должна отражать, что естественного заражения человека и воспроизводимо приводят к схожим патологии достаточной продолжительности для обеспечения терапевтического вмешательства. Методы используются не должны ограничивать применимость процедуры и не должны способствовать болезни исхода 20. Модель H. инфекции менингита в крысят, разработанных Моксон и коллег удовлетворяет этим критериям 20; естественное заражение происходит после колонизация слизистой оболочки верхних дыхательных путей и этой важной особенностью была воспроизведена в крысят неисполнением травмыкрестики инстилляция бактерий на мембранах носовых проходов. Важно отметить, что возраст-зависимых природы инфекции была воспроизведена в модели.

Та же группа также были первыми, чтобы разработать неинвазивный модель Е. палочка K1 НБМ в неонатальном крысы 22. Возбудитель свободной Спрэг Dawley щенков колонизирована кормления 10 от 8 до 10 10 бактерий через устное желудочного зонда; инокулята поэтому значительно выше, чем у занятых нами. Колонизация с тремя штаммами K1 рассмотрены, C94 (О7: K1: Н-), ЕС3 (O1: K1: Н) и LH (O75: K1: H3), произошло в относительно высокой доле (48-74%) от K1 кормили животных, но случаи бактериемии, менингита и смертности были изменчивы и значительно ниже, чем темпы колонизации. Клональная характер Е. палочка K1 экспериментальная инфекция была создана позже 23 и в настоящее время очевидно, что только О18: K1 и, в меньшей степени, О7: K1 серотипов способныпоследовательно вызвать системные инфекции. По этой причине, эти исследования патогенеза neuropathogenic Е. палочка К1 были основаны на использовании вирулентности повышенной O18: K1 штамма A192PP. Сравнение Е. палочка K1 кормление новорожденных крыс через желудочный зонд, как используемых Glode и коллег 22, и к способу подачи капель, как работают группой Achtman в 23 выявленных чрезмерное количество смертей, используя первый метод, почти наверняка из-за повреждения слизистой поверхности от желудочный зонд. Как темпы колонизации сравнимы с этими двумя способами, рекомендуется использовать менее инвазивный метод кормления бактерии с помощью пипетки со стерильным наконечником, как описано в этой связи.

Кишечная палочка A192PP штамм, используемый в наших исследованиях является О18: K1. Это более вирулентными производное клинического штамма Е. палочка A192, который был первоначально оправился от пациента с сепсисом 27 </SUP>. Повышенное вирулентности штамма была получена последовательным пропусканием через 26 новорожденных крыс. Штамм вызывает на тяжесть заболевания зависит от возраста, со 100% бактериемии и смертности при введении 2-дневных животных 28. В отличие от этого, 9-дневных животных полностью устойчивы к заболеванию. К1 конкретных литического бактериофаг может быть использован для дифференциации E. палочка K1 от другой Е. палочка напрягает 29. В этом исследовании, восприимчивость жизнеспособных бактерий на бактериофага K1E должны использоваться для (I) проверить чистоту Е. палочка K1 суспензии готов быть подан на животных, и (II), чтобы дифференцировать E. палочка K1 от других колиформных бактерий в целях исчисления жизнеспособность в перианальных мазков, крови и образцах тканей. Если колония E. палочка К1, то это будет восприимчив к бактериофага K1E лизиса, и бактериальный рост будет запрещено в месте прививки бактериофага. Если колония не E. палочка К1, он будет бе устойчивы к лизису KIE бактериофага, и не должно быть площадь роста бактерий в месте прививки бактериофага. Следует иметь в виду, что животные модели не может отразить все особенности природного болезни. Текущая модель может быть модифицирована, чтобы исследовать характеристики вирулентности, кроме Е. neuropathogenic бактерий палочка A192PP и вариации размера колонизации посевного материала могут быть размещены. Будущие приложения технике может включать оценку столь необходимых препаратов для лечения этого заболевания, а также раскрыть информацию о принимающей ответ на колонизации и ткани вторжения.

Метод, описанный здесь прост, но эффективен. Отдельные пометы 10 – 12 щенков были использованы в качестве тестовых или контрольных групп, и это в-помета подход обеспечивает высокую степень воспроизводимости и статистической достоверности. Крайне важно, чтобы щенки вернулись в свои природные матерей как можно скорее после того, как любой procedurе и пометы не следует поэтому содержать животных, перенесших различные мероприятия. Важно, что ФРС посевной согреться иначе щенки отклонит предложенную культуру. Щенки быстро разработать сложный микробиоты и в течение двух дней после рождения тракта GI колонизирована с широким спектром бактерий из фил установленном в качестве наиболее распространенных микробов в детской и взрослой кишечнике. Детенышей, которые не были кормили E. палочка A192PP не несут Е. палочка K1 в желудочно-кишечном тракте 17 и так определение темпов колонизации относительно проста. Тем не менее, Neus -based метод КПЦР для обнаружения колонизации E. палочка K1 гораздо более чувствительны, что традиционные методы культивирования и настоятельно рекомендуется 17.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана исследовательских грантов G0400268 и MR / K018396 / 1 от Совета по медицинским исследованиям, и по действий медицинских исследований. Дальнейшая поддержка была предоставлена ​​Национальным институтом Университета здоровья Исследование колледжа Лондона Больницы биомедицинских исследований Центра.

Materials

Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) Harlan, UK www.harlan.com
E. coli K1 A192PP Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Bacteriophage K1E Taylor lab www.ucl.ac.uk Mushtaq et al. 2004
Glycerol  Sigma, UK www.sigmaaldrich.com G5516
Mueller-Hinton Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0337
Mueller-Hinton Broth Oxoid, UK www.oxoid.com CM0405
MacConkey Agar Oxoid, UK www.oxoid.com CM0007
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P4417
Ethanol 100% Sigma, UK www.sigmaaldrich.com E7023
Heparin Sodium Salt Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 84020
Prepare 20-50 units/ml
RNAlater Solution Sigma, UK www.sigmaaldrich.com R0901
10µl/mg tissue
Acetic Acid Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 320099
Chloroform Sigma, UK www.sigmaaldrich.com C2432
Methanol Sigma, UK www.sigmaaldrich.com 322415
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 11542483
Alcotip Swabs Scientific Laboratory Supplies, UK www.scientificlabs.co.uk SWA1000
Petri dishes Sigma, UK www.sigmaaldrich.com P5856
30mL Universal Tube AlphaLaboratories, UK www.alphalabs.co.uk CW3890
0.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1405-1500
1.5ml microcentrifuge tubes StarLab, UK www.starlab.co.uk I1415-1000
0.1µl calibrated loops StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-0112
L-shaped spreaders StarLab, UK www.starlab.co.uk E1412-1005
Cuvettes Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 10594175
Forceps straight with fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12780036
Forceps straight with blunt tips Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12391369
Forceps watchmaker's curved with very fine points  Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12740926
Scissors straight with very fine points Fisher Scientific, UK www.fisher.co.uk 12972055
Laboratory Scissors VWR, UK www.vwr.com USBE4251
25g Syringe Needles Greiner Bio-One Ltd www.greinerbioone.com N2525
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers PerkinElmer, UK www.perkinelmer.co.uk L60000BB
Unitemp Incubator B&T, UK OP958
Multitron shaking incubator INFORS HT, UK www.infors-ht.com AJ118
Ultra-Turrax T-10 homogenizer IKA Werke www.ika.com 0003737000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
  2. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
  3. Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
  4. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  5. Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).
  6. Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
  7. Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
  8. Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
  9. Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
  10. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
  11. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
  12. Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
  13. Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
  14. Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
  15. Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
  16. Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
  17. Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
  18. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
  19. Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
  20. Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
  21. Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
  22. Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
  23. Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
  24. Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
  25. Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
  29. Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).

Tags

Neuropathogenic Escherichia ColiNeonatal RatNon-invasive Infection ModelGut-lymph-blood-brain InfectionAge-dependent InfectionE. Coli O18:K1VirulenceMeningeal InvasionCentral Nervous System InfectionPathogenesisTherapeutic InterventionsBacterial Virulence

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M. H., Taylor, P. W. Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat. J. Vis. Exp. (92), e52018, doi:10.3791/52018 (2014).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image