هنا، يتم وصف هذا الإجراء لإنشاء العدوى النظامية في الفئران حديثي الولادة مع ثقافات القولونية K1. يسمح هذا الإجراء غير الغازية استعمار الجهاز الهضمي، النبات من الممرض إلى الدوران الجهازي، وغزو النظام العصبي المركزي في الضفيرة المشيمية.
التحقيق في التفاعلات بين المضيف الحيواني والممرض الجرثومي هو معنى فقط اذا كان النموذج إصابة العاملين يعيد ملامح الرئيسية للعدوى الطبيعية. يصف هذا البروتوكول الإجراءات لإنشاء وتقييم العدوى النظامية بسبب ممرض للأعصاب K1 القولونية في الفئران حديثي الولادة. استعمار الجهاز الهضمي يؤدي إلى نشر الممرض على طول مجرى القناة الهضمية-الليمفاوية الدم في الدماغ من الإصابة ويعرض نموذج الإعالة العمرية قوية. سلالة من E. القولونية O18: K1 مع تعزيز الفوعة للجرذ حديثي الولادة ينتج معدلات عالية بشكل استثنائي من الاستعمار، النبات إلى المقصورة الدم وغزو السحايا بعد المرور عبر الضفيرة المشيمية. كما هو الحال في الإنسان المضيف، ويرافق اختراق الجهاز العصبي المركزي التهاب المحلي والنتيجة فتاكة دائما. هذا النموذج هو لفائدة ثبت للدراسات آليةالمرضية، لتقييم التدخلات العلاجية وتقييم الفوعة البكتيرية.
التهابات جرثومية جهازية تشكل تهديدا كبيرا للرفاه وبقاء الأطفال حديثي الولادة. الخدج أكثر عرضة بشكل خاص. التهاب السحايا الجرثومي حديثي الولادة (NBM)، وكثيرا ما يرتبط مع الإنتان الجرثومي، لا يزال يشكل مصدرا مهما للوفيات والمراضة أثناء الأسابيع القليلة الأولى من الحياة، وتفاقم المشكلة عن طريق التطور المستمر للمقاومة لعقاقير مضادة للجراثيم المواجهة 1،2. وهناك حالة من NBM حالة طبية طارئة أن يحمل عبء الطبي والاجتماعي والاقتصادي المرتفع 3؛ وبالتالي، هناك حاجة ملحة لعلاجات جديدة وخاصة، استراتيجيات وقائية جديدة للحد من عبء المرض. بعض ملامح NBM غير عادية: في العالم المتقدم، كولاي والمكورات العقدية المجموعة الثانية هي المسئولة عن الغالبية العظمى من الحالات وقدرة هذه السلالات لانتزاع NBM يكاد يرتبط دائما مع وجود السكاريد كاليفورنيا الواقيةpsule تمكن الممرض للتهرب من الاعتراف المناعة العمليات 4. وهناك نسبة عالية جدا (80-85٪) من neuroinvasive E. القولونية التعبير عن كبسولة K1 5،6، وهو بوليمر حمض polysialic المرتبطة α-2،8 مطابق هيكليا لاستضافة جهري من اللدونة العصبية 7.
ان تقييم علاجات جديدة واقية لNBM وتجرثم الدم والإنتان المرتبطة تستفيد بشكل واضح من نموذج حيواني قوية من العدوى التي يحاكي الملامح الرئيسية لهذا المرض في الوليد البشري، ولا سيما قوية سن التبعية والمسار الطبيعي للعدوى . وهناك مجموعة واسعة من النماذج لالتهاب السحايا الجرثومي إيجابية الجرام وسالبة الجرام متاحة 8،9 وهذه لها بمد كبير معرفتنا خيارات المرضية، الفيزيولوجيا المرضية والعلاج في هذه الالتهابات. وبالتالي، استخدمت الالتهابات التجريبية في الجرذان والفئران والأرانب والقردة لدراسة التهاب السحايا في كل من نeonate والكبار. ومع ذلك، فإن العديد من هذه النماذج تستخدم حقن الصهريج أو تحت الجلد مباشرة من البكتيريا لبدء العدوى، وخلق التسبب الاصطناعي من خلال تجاوز العمليات الطبيعية للنشر من موقع الاستعمار. في بعض الحالات أدت هذه الأساليب التلقيح إلى تغييرات كبيرة في علم الأمراض. على سبيل المثال، الإدارة تحت الجلد من E. ألغت سلالات القولونية K1 للالإعالة العمرية المرتبطة عدوى الطبيعي، وتنتج تجرثم الدم والغزو من الجهاز العصبي المركزي (CNS) في كل من حديثي الولادة والبالغين 10. الاستعداد لE. القولونية NBM يعتمد بشكل حاسم على الانتقال الرأسي للعامل المسبب للمرض من الأم إلى الرضيع عند أو بعد الولادة مباشرة 11. أمومي المستمدة من E. البكتيريا القولونية K1 استعمار الجهاز الهضمي حديثي الولادة (GI) المسالك 11-13، والتي هي عقيمة عند الولادة ولكنه يكتسب الجراثيم معقدة بسرعة 14. في حديثي الولادة المستعمر، E. القولونيةK1 البكتيريا لديها القدرة على نقل من من لمعة الأمعاء إلى الدورة الدموية الجهازية قبل الدخول إلى الجهاز العصبي المركزي في الدماغ عبر الدم أو الدم النخاعي الحواجز السوائل 9،15. تصميم نماذج قوية من العدوى التجريبية يجب أن تأخذ بعين الاعتبار هذه التفاصيل.
على الرغم من أن الفئران التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة بعض أشكال التهاب السحايا الجرثومي 8، فهي غير صالحة للدراسات عدوى حديثي الولادة: يتم طغت من قبل الإصابة الجهازية وعدم إظهار السمة الإعالة العمرية قوية للرضع الإنسان 16. وعلاوة على ذلك، defensins α، الببتيدات الرئيسية الجهاز الهضمي توفير الحماية ضد الغزو النظامية التي كتبها E. القولونية K1 17، يتم التعبير بشكل كبير في خلايا بانيت والعدلات في البشر والفئران ولكن ليس في الفئران (18). هناك درجة ملحوظة من الازدواجية والتكرار وعدم التجانس في الماوس defensin والجينات cryptidin ذات الصلة التي لا توجد في غيرها وimals 19. وقد استخدمت الفئران حديثي الولادة في البداية من قبل Moxon وزملاء العمل 20 للتحقيق في الآلية المرضية لالتهاب السحايا المستدمية النزلية بعد التلقيح داخل الأنف، تكرار الموقع الطبيعي للاستعمار هذا الممرض حديثي الولادة في الإنسان، وتكييفها لاحقا لتعتمد على سن E. القولونية K1 تجرثم الدم والتهاب السحايا. Bortolussi وآخرون 21 حقن داخل الصفاق العاملين من اللقاح البكتيري لبدء الإصابة ولكن الدراسة الرئيسية Glode وزملاء العمل 22 المستخدمة للتغذية في المعدة عن طريق الفم موازية الطريق الطبيعي للعدوى بعد GI الاستعمار. كما أنبوب المعدة قد يضر الأسطح المخاطية، وقد تم تطوير هذا الإجراء ليشمل التغذية من اللقاح إلى الأطفال حديثي الولادة 23. هنا، وطريقة للاستعمار الجهاز الهضمي وإجراءات لتتبع العدوى في وصفها الفئران الوليدة الحساسة؛ بالإضافة إلى ذلك، تمت مناقشة التطبيقات العلاجية والوقائية للنموذج.
نموذج الحيوان الموصوفة هنا يبني على الأعمال السابقة التي تهدف لإعادة إنتاج السمات البارزة من الالتهابات التي تحدث بشكل طبيعي في البشر. كانوا يعملون الفئران حديثي الولادة في البداية لدراسة التهاب السحايا الرضع بسبب H. النزلية نوع (ب) كما اقتنعت الأنواع المعايير الرئيسية لنموذج قوي للعدوى. وبالتالي، يجب على بوابة دخول العوامل المسببة للأمراض ذات الصلة التي تعكس من العدوى البشرية الطبيعي وتعطي بتكاثر ترتفع إلى أمراض مماثلة لفترة كافية للسماح للتدخل العلاجي. التقنيات المستخدمة يجب أن لا تحد من إمكانية تطبيق هذا الإجراء ويجب أن لا تساهم في نتائج المرض 20. نموذج H. النزلية التهاب السحايا في الفئران الرضع التي وضعتها Moxon وزملاؤه يلبي هذه المعايير 20؛ تحدث العدوى الطبيعي بعد تكرار الاستعمار في الأغشية المخاطية في الجهاز التنفسي العلوي وهذه ميزة مهمة في الفئران الوليدة من غير الصدمةتقطير التشنج من البكتيريا على أغشية الممرات الأنفية. الأهم من ذلك، وتكرر الطبيعة تعتمد على عمر العدوى في النموذج.
وكانت نفس المجموعة أيضا أول من وضع نموذجا غير الغازية من E. القولونية K1 NBM في الفئران حديثي الولادة 22. كانت مستعمرة خالية من العوامل الممرضة الجراء سبراج داولي عن طريق تغذية 10 أغسطس – 10 أكتوبر البكتيريا عن طريق أنبوب المعدة عن طريق الفم. كان اللقاح بالتالي أعلى بكثير من تلك المستخدمة من قبلنا. استعمار مع سلالات K1 ثلاثة فحصت، C94 حدث، في نسبة كبيرة نسبيا (48-74٪) من (O7: K1: H-)، EC3 (O1: K1: H-) وLH (H3 O75: K1) الحيوانات K1 التي تغذيها، ولكن حالات تجرثم الدم والتهاب السحايا وفيات متغير وأقل بكثير من معدلات الاستعمار. طبيعة نسيلي من E. تأسست العدوى التجريبية القولونية K1 بعد 23 ومن الواضح الآن أن O18 فقط: K1، وإلى حد أقل، O7: الأنماط المصلية K1 قادرةأن تسبب عدوى باستمرار النظامية. لهذا السبب، فإن هذه التحقيقات من التسبب في ممرض للأعصاب E. واستندت القولونية K1 على استخدام محسنة الفوعة O18: K1 سلالة A192PP. مقارنة بين E. التغذية القولونية K1 من الفئران حديثي الولادة عن طريق أنبوب المعدة، كما يستخدمه Glode وزملاؤه 22، وطريقة التغذية قطرة كما تستخدمها مجموعة Achtman في 23 كشفت أرقام كبيرة من الوفيات باستخدام الأسلوب السابق، يكاد يكون من المؤكد بسبب الأضرار التي لحقت المخاطية السطوح من قبل أنبوب المعدة. كما نسب الاستعمار قابلة للمقارنة مع هاتين الطريقتين، فمن المستحسن استخدام الأسلوب أقل الغازية لتغذية البكتيريا باستخدام ماصة مع طرف عقيمة، كما هو موضح في هذه الاتصالات.
كولاي سلالة A192PP المستخدمة في دراساتنا هو O18: K1. وهو مشتق أكثر ضراوة من سلالة السريري E. القولونية A192 التي تم استرداد الأصل من المريض مع تسمم الدم 27 </سوب>. تم الحصول على زيادة الفوعة من سلالة قبل مرور تسلسلي من خلال الفئران حديثي الولادة 26. سلالة يثير لشدة المرض تعتمد على السن، مع 100٪ تجرثم الدم وفيات عندما تدار ل2 يوم 28 الحيوانات القديمة. في المقابل، الحيوانات القديمة يوم 9 مقاومة تماما للمرض. يمكن استخدام K1 محددة الجراثيم التحللي للتمييز E. القولونية E. K1 من الآخرين سلالات القولونية 29. في هذه الدراسة، يجب أن تستخدم حساسية البكتيريا قادرة على البقاء لK1E عاثية إلى (ط) تحقق نقاء E. تعليق القولونية K1 أعدت لتغذية الحيوانات، و (ii) للتمييز E. القولونية K1 من القولونيات أخرى لاحتساب الجدوى في مسحات حول الشرج، والدم وعينات الأنسجة. إذا كانت مستعمرة هي E. القولونية K1، فإنه سيكون عرضة للعاثية K1E تحلل، وسيتم تثبيط نمو البكتيريا في موقع التلقيح عاثية. إذا كانت مستعمرة ليست E. القولونية K1، سيكون بمقاومة للتحلل KIE عاثية البريد، ويجب أن تكون هناك مساحة للنمو البكتيري في موقع التلقيح عاثية. وينبغي أن يوضع في الاعتبار أن النماذج الحيوانية لا يمكن أن تعكس كل مظاهر المرض تحدث بشكل طبيعي. يمكن تعديل النموذج الحالي لدراسة خصائص الفوعة البكتيريا ممرض للأعصاب أخرى من E. يمكن استيعاب القولونية A192PP والاختلافات في حجم اللقاح استعمار. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية لتقنية تقييم الأدوية التي تشتد الحاجة إليها لعلاج حالة وللكشف عن تفاصيل استجابة المضيف للاستعمار وغزو الأنسجة.
الطريقة الموصوفة هنا هو بسيطة لكنها فعالة. تم توظيف 12 الجراء مثل اختبار أو سيطرة الجماعات وهذا النهج داخل القمامة يضمن درجة عالية من التكاثر وصحة الإحصائية – الفضلات واحدة من 10. لا بد من أن يتم إرجاع الجراء لأمهاتهم الطبيعية في أقرب وقت ممكن بعد أي الاجراءلذا لا ينبغي أن تشمل البريد والفضلات الحيوانات تمر التدخلات المختلفة. من المهم أن اللقاح بتغذية أن تكون درجة حرارة وإلا فإن الجراء سيرفض الثقافة المقدمة. الجراء تتطور بسرعة والجراثيم معقدة وخلال يومين من الولادة واستعمرت الجهاز الهضمي مع مجموعة واسعة من البكتيريا من الكائنات الحية من تأسيس مثل الميكروبات الأكثر وفرة في الرضع والبالغين الأمعاء. الجراء التي لم يتم تغذيتها E. القولونية A192PP لا تحمل E. K1 القولونية في الجهاز الهضمي 17 وحتى تحديد معدلات الاستعمار هو بسيط نسبيا. ومع ذلك، المستندة على neuS QPCR طريقة للكشف عن استعمار E. القولونية K1 هو أبعد ما يكون أكثر حساسية أن أساليب الثقافة التقليدية ويوصى بقوة 17.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل عن طريق المنح البحثية G0400268 وMR / K018396 / 1 من مجلس البحوث الطبية، وعمل أبحاث الطبية. وقدمت المزيد من الدعم من قبل المعهد الوطني للكلية لندن المستشفيات مركز البحوث الطبية الحيوية بجامعة بحوث الصحية.
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) | Harlan, UK | www.harlan.com | |
E. coli K1 A192PP | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Bacteriophage K1E | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Glycerol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | G5516 |
Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0337 |
Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0405 |
MacConkey Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0007 |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P4417 |
Ethanol 100% | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | E7023 |
Heparin Sodium Salt | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 84020 Prepare 20-50 units/ml |
RNAlater Solution | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | R0901 10µl/mg tissue |
Acetic Acid | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 320099 |
Chloroform | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | C2432 |
Methanol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 322415 |
Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 11542483 |
Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK | www.scientificlabs.co.uk | SWA1000 |
Petri dishes | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P5856 |
30mL Universal Tube | AlphaLaboratories, UK | www.alphalabs.co.uk | CW3890 |
0.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1405-1500 |
1.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1415-1000 |
0.1µl calibrated loops | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-0112 |
L-shaped spreaders | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-1005 |
Cuvettes | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 10594175 |
Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12780036 |
Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12391369 |
Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12740926 |
Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12972055 |
Laboratory Scissors | VWR, UK | www.vwr.com | USBE4251 |
25g Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd | www.greinerbioone.com | N2525 |
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK | www.perkinelmer.co.uk | L60000BB |
Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK | www.infors-ht.com | AJ118 |
Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke | www.ika.com | 0003737000 |