Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em> Ex-ovo</em> Elektroporatie Aanpak
Summary
Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.
Abstract
De kegel fotoreceptor-verrijkte culturen afkomstig van embryonale kuiken netvlies hebben een onmisbaar instrument voor onderzoekers over de hele wereld het bestuderen van de biologie van retinale neuronen, in het bijzonder fotoreceptoren geworden. De toepassingen van dit systeem verder fundamenteel onderzoek, omdat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan high throughput technieken voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Echter, genetische manipulatie van retinale fotoreceptoren in deze culturen heeft bewezen zeer uitdagend, stellen een belangrijke beperking van de bruikbaarheid van het systeem. We hebben onlangs ontwikkeld en gevalideerd ex ovo plasmide electroporatietechniek dat de snelheid van transfectie van retinale cellen in deze kweken stijgt met vijfvoudige vergelijking met andere momenteel beschikbare protocollen 1. Bij deze methode embryonale kuiken ogen enucleatie in stap 27, de RPE verwijderd en het netvlies beker wordt geplaatst in een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd gebruik gemakkelijk geconstrueerd custom-maakte elektroden. De netvliezen worden vervolgens gedissocieerd en gekweekt met behulp van standaardprocedures. Deze techniek kan worden toegepast op overexpressie studies en de neerwaartse regulatie van genexpressie, bijvoorbeeld via het gebruik van plasmide-aangedreven RNAi technologie, vaak bereiken transgenexpressie in 25% van de fotoreceptor bevolking. De video-indeling van de huidige publicatie zal deze technologie gemakkelijk toegankelijk zijn voor onderzoekers in het veld te maken, waardoor de studie van gen-functie in de primaire retinale culturen. We hebben ook uitgebreide uitleg van de kritische stappen van deze procedure voor een succesvol resultaat en reproduceerbaarheid.
Introduction
Gedissocieerde celkweken uit embryonale kuiken netvlies zijn op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten van fotoreceptorcellen celbiologie, inclusief hun overleving 2-9, differentiatie 10-12, neuriet uitgroei 13 en meer bestuderen. De voordelen van dit systeem, in de jaren 1980 ontwikkeld door Ruben Adler en medewerkers en geperfectioneerd door zijn andere groepen 14-20, bevinden zich in de intrinsieke kenmerken van het kuiken als diermodel 21. De grote omvang van het kuiken oog, zelfs in embryonale stadia, levert grote hoeveelheden materiaal te kweken. Bovendien, wanneer cultures worden uitgevoerd met embryonale dag (ED) 5 – 6 retina, 55 – 80% van de stamcellen differentiëren fotoreceptoren 14,15,18,22,23, en omdat ongeveer 86% van de fotoreceptoren in dit dier kegels 24, deze culturen zijn bijzonder geschikt voor studies gericht op dit celtype.
We hebben onlangs developed en het kenmerk van een eenvoudige techniek die zorgt voor hoge-efficiëntie plasmide transfectie van de cellen in deze kweken, is de bruikbaarheid van dit systeem verbreden door het faciliteren genetische studies missexpression 1. De ontwikkeling van deze techniek kwam voort uit een leegte in de wetenschappelijke literatuur methoden die een aanvaardbaar niveau van transfectie zou bieden om voor de studie van gen in een cel autonoom. Dit is voor een deel omdat de primaire neuronale culturen zijn notoir moeilijk te transfecteren 25,26. Enkele van de meest gebruikte technieken die eerder voor dit doel opgenomen chemische transfectie werkwijzen zoals lipofectie of calcium-fosfaat-gemedieerde transfectie, die leiden tot efficiëntie in de orde van 3-5% en kan aanzienlijke toxiciteit 27-32 uitoefenen. Hoewel het gebruik van plasmiden met een enzymatische reporter systeem het probleem van slechte transfectie-efficiëntie kan omzeilen door het amplificeren van het signaal, ze nietdiscrimineren celspecifieke effecten en de resultaten zijn gebaseerd op een klein celpopulatie die niet representatief zijn voor het geheel kan zijn. Een andere veel gebruikte methode in de chick, RCAS virusinfectie, is alleen van toepassing op delende cellen en dus niet geschikt voor deze primaire retinale kweeksysteem 33.
In het huidige protocol zijn embryonale kuiken ogen enucleatie in stadium 27 (ED 5), het retinale pigmentepitheel (RPE) is verwijderd en de retinale beker wordt geplaatst in een elektroporatie kamer gevuld met een plasmide bevattende oplossing en geëlektroporeerd met behulp maat elektroden, gevolgd door retinale dissociatie en cultuur met standaardtechnieken 21. Na optimalisatie procedure we in staat om consistent bereiken transfectie-efficiëntie in de orde van 22% van het totale aantal cellen in kweek en 25% binnen de fotoreceptor populatie alleen zijn geweest zonder de overleving en differentiatie kenmerken van de1 kweken. Hier geven we een gedetailleerd protocol waarin alle belangrijke stappen van de procedure teneinde het succes en de reproduceerbaarheid van deze techniek waarborgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stap voor het succes van dit protocol is het selecteren van de juiste fase van het embryo. In eerdere publicaties is een aantal embryonale stadia die voor deze culturen doorgaans bepaald door de tijd van incubatie of embryonale dag (ED); dus is het meestal aangenomen dat het gebruik van ED 5 tot ED 6 embryo's zullen gelijkwaardige resultaten opleveren. We hebben echter gevonden dat het podium 27 (ED 5), wordt transfectie-efficiëntie ongeveer 22% van de totale celpopulatie, zoals hierboven vermeld…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David O’Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.
Materials
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5mm square box filament, 4.5mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco – Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1×2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width |
Referencias
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., O’Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
- Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
- Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
- Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
- Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
- Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
- Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
- Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
- Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
- Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
- Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
- Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
- Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
- Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the ‘window-labeling’ technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
- Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
- Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
- Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
- Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
- Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
- Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
- Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
- Boatright, J. H., et al. The 5′ flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
- Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
- Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
- Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
- Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
- Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
- Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
