Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em> Eski-ovo</em> Elektroporasyon Yaklaşımı
Summary
Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.
Abstract
Embriyonik civciv retina elde edilen koni fotoreseptör zenginleştirilmiş kültürler retinal nöronların, özellikle fotoreseptör biyoloji okuyan dünyadaki araştırmacılar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kolayca ilaç gelişimi için yüksek verimli teknolojileri için adapte edilebilir, bu sistemin uygulamalar temel araştırma ötesine geçmektedir. Bununla birlikte, bu kültürlerde retina fotoreseptörlerinin genetik manipülasyon sisteminin yararlılığını önemli bir sınırlandırma getirmeden, çok zor olduğu kanıtlanmıştır. Biz son zamanlarda geliştirilen ve diğer mevcut protokoller 1 ile karşılaştırıldığında beş kat bu kültürlerde retina hücrelerinin transfeksiyon hızını artırır plazmid elektroporasyon tekniği ovo bir eski valide. Bu yöntemde, civciv embriyosu gözler RPE çıkarılır, evre 27 de enükle edilir ve retina kap bir plasmid ihtiva eden bir çözeltiye yerleştirilmiş ve kolaylıkla inşa alışılagelmiş kullanılarak elektroporasyonayapılan elektrotlar. Retinalar sonra ayrışmış ve kültürlü standart prosedürleri kullanıyor. Bu teknik genel olarak, fotoreseptör nüfusunun% 25 transgen ekspresyonunu elde plazmit odaklı RNAi teknolojisinde kullanımı ile, örneğin, fazla sentezlenme çalışmaları yanı sıra, gen ekspresyonunda azalma uygulanabilir. Mevcut yayın video formatı primer retina kültürlerde gen fonksiyonu çalışma sağlayan, alanında araştırmacılara bu teknoloji kolayca erişilebilir hale getirecektir. Biz de başarılı bir sonuç ve tekrarlanabilirlik için bu prosedürün kritik adımlar ayrıntılı açıklamalar dahil ettik.
Introduction
Embriyonik civciv retina gelen ayrışmış hücre kültürleri yaygın olarak kendi yaşam 2-9, farklılaşma 10-12, neurite akıbet 13, ve daha fazlasını içeren fotoreseptör hücre biyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için kullanılmıştır. Ruben Adler ve işbirlikçileri tarafından 1980'li yıllarda geliştirilen ve onun ve diğer gruplar 14-20 tarafından mükemmelleştirilmiş bu sistemin avantajları, bir hayvan modelinde 21 olarak civciv içsel özelliklerinin bulunması. Hatta embriyonik aşamada civciv gözün büyük boy, kültürlerin için malzeme büyük miktarlarda sağlar. Kültürler embriyonik gün (ED) 5 kullanılarak yapılır Dahası, – 6 retinalar, 55 – Bu hayvanda fotoreseptör yaklaşık% 86 olduğu için kendi progenitör hücrelerin% 80 Fotoreseptörlerin 14,15,18,22,23 olarak ayırt ve koniler 24, bu kültürler, bu hücre tipi ilgili çalışma için özellikle uygundur.
Biz son zamanlarda develo varped ve böylece, genetik missexpression çalışmaları 1 kolaylaştırarak bu sistem kullanışlılığı genişletilmesi, bu kültürlerde hücre yüksek verimli plazmid transfeksiyon sağlayan basit bir teknik ile karakterize edilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, bir hücre bağımsız bir şekilde gen fonksiyonlarının araştırılmasında izin vermek için transfeksiyon kabul edilebilir bir düzeyde sağlayacak yöntemler bilimsel literatürde bir boşluk kaynaklanmıştır. Primer nöronal kültürlerin 25,26 transfect herkesin bildiği zor, çünkü bu bölümünde yer almaktadır. Bu amaç için daha önce mevcut olan en yaygın olarak kullanılan tekniklerin bazıları 3-5% sırasına verim neden olur ve ciddi yan etkilere 27-32 uygulayabilir gibi lipofeksiyon veya kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon gibi kimyasal nakil yöntemlerini, dahildir. Enzimatik muhabir sistemi ile Plazmidlerin kullanılması sinyalini yükselterek yoksul transfeksiyon verimlilik sorunu aşmak olsa bile, onlar değilHücre-spesifik etkileri ayırt ve bunların sonuçları bütünün temsilcisi olmayabilir küçük bir hücre popülasyonu dayanmaktadır. Civciv Yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, RCAS virüsü enfeksiyonu, çoğalan hücreler için geçerlidir, bu primer retina kültür sistemine 33 dolayısıyla uygun değildir.
Mevcut protokolde civciv embriyosu gözler evre 27 (ED 5), retinal pigment epitel (RPE) çıkarılır ve retina kap bir plasmid ihtiva eden çözelti ile doldurulmuş bir elektroporasyon odasına yerleştirilen en çıkarılmış ve kullanılarak, elektroporasyon bakımından güçlü ölçüye standart teknikler kullanılarak retina ayrışması 21 ve kültür izledi elektrotlar. Bu prosedürü optimize sonra hayatta kalma ve farklılaşma özelliklerini ödün vermeden sürekli, kültür hücreleri ve yalnız fotoreseptör nüfus içinde% 25 toplam sayısının% 22 mertebesinde transfeksiyon verimliliği elde etmek mümkün olmuşturKültürler 1. Burada bu tekniğin başarı ve yeniden üretilebilirlik sağlamak için, bu prosedür tüm önemli adımları gösteren bir detaylı bir protokol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün başarısı için en kritik adım embriyoların uygun sahne seçmektir. Önceki yayınlarda, embriyonik gelişim evrelerinin bir dizi tipik kuluçka veya embriyonik gün gün (ED) tarafından tanımlanan, bu kültürlerin verilir; Böylece genellikle ED 6 embriyolar ED 5 kullanarak eşdeğer sonuçlar verecektir varsayılmaktadır. Bununla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi sahne 27 (ED 5) üzerine, transfeksiyon verimi, toplam hücre nüfusunun yaklaşık% 22 olacak olduğunu bulmuşlardır; Henüz v…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David O’Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.
Materials
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5mm square box filament, 4.5mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco – Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1×2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width |
Referencias
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., O’Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
- Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
- Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
- Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
- Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
- Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
- Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
- Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
- Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
- Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
- Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
- Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
- Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
- Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the ‘window-labeling’ technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
- Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
- Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
- Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
- Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
- Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
- Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
- Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
- Boatright, J. H., et al. The 5′ flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
- Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
- Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
- Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
- Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
- Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
- Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
