Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований:<em> Экс-ово</em> Электропорация подход

Диссоциированные клеточные культуры из эмбриональных куриных сетчатки были широко используется для изучения различных аспектов фоторецепторов клеточной биологии, в том числе их выживания ^2-9 дифференциации ^10-12 роста невритов ^{13 и} более. Преимущества этой системы, разработанные в 1980-х годах Рубен Адлер и сотрудников и совершенствуется его и других групп ^14-20, проживают в собственных характеристик кур в качестве животной модели ^21. Большой размер куриного глаза, даже при эмбриональных стадиях, обеспечивает большое количество материала для культур. Более того, когда культуры осуществляется с помощью эмбриональных день (ED) 5 – 6 сетчатки, 55 – 80% от их клеток-предшественников дифференцировать, как фоторецепторов ^{14,15,18,22,23,} и примерно с 86% фоторецепторов этого животного конусы ^24, эти культуры являются особенно подходящими для исследований, направленных на этом типе клеток.

Мы недавно развитPED и характеризуется простой метод, который позволяет для высокой эффективности плазмиды трансфекции клеток в этих культурах, тем самым расширяя полезности этой системы путем содействия генетическая missexpression исследования ^1. Развитие этой методики вытекает из пустоты в научной литературе методов, которые обеспечили бы приемлемый уровень трансфекции, чтобы позволить для изучения функции генов в автономном режиме клеток. Это отчасти потому, что первичные нейронов культуры, как известно, трудно трансфекции ^25,26. Некоторые из наиболее часто используемых методов, ранее доступные для этой цели включены химические методы трансфекции, такие как липофекции или опосредованную фосфатом кальция трансфекции, что приводит к повышению эффективности в порядке 3-5% и может оказывать значительное токсичности ^27-32. Хотя использование плазмид с ферментативной системой репортер может обойти проблему низкой эффективности трансфекции путем амплификации сигнала, они недискриминацию эффекты соты, и их результаты основаны на небольшом клеточной популяции, которая не может быть представителем в целом. Другим широко используемым методом в куриных, RCAS вирусная инфекция, это применимо только к пролиферирующих клеток и, таким образом, не подходит для этой первичной сетчатки системы культуры ^33.

В текущем протоколе эмбриональных куриных глаза энуклеировали на этапе 27 (ED 5), сетчатки пигментного эпителия (РПЭ) удаляется, и сетчатки чашки помещают в электропорации камере, заполненной плазмиды, содержащей раствор и подвергали электропорации с использованием заказ Электроды с последующим сетчатки диссоциации и культуры с использованием стандартных методик. ²¹ После оптимизации этой процедуры, мы были в состоянии последовательно достичь эффективности трансфекции порядка 22% от общего числа клеток в культуре и 25% в фоторецепторов населения только, без ущерба для выживания и дифференцировки характеристикикультуры ^1. Здесь мы предлагаем подробный протокол с изложением все важные этапы этой процедуры для того, чтобы обеспечить успех и воспроизводимость этого метода.