차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em> 전 비켜</em> Electroporation에 접근

배아 병아리 망막에서 해리 된 세포 배양 널리 생존 ^2-9, 차별화 ^10-12, 신경 돌기의 파생물 ⁽¹³⁾ 등을 포함한 광 수용체 세포 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용되었다. 루벤 애들러와 공동 작업자에 의해 1980 년대에 개발하고 자신과 다른 그룹 ^(14-20)에 의해 완성이 시스템의 장점은, 동물 모델 ^(21)와 여자의 고유 특성에 있습니다. 심지어 배아 단계에서 병아리 눈의 큰 크기는, 문화에 대한 자료의 많은 양을 제공한다. 배아는 배양 일 (ED) 5 이용하여 수행 될 때 더욱이, – 6 망막, 55 -이 동물 감광체의 약 86 %이기 때문에 그들의 선조 세포의 80 %가 감광체 ^{14,15,18,22,23으로} 구별하고, 콘 ^(24)은,이 배양 물이 세포 유형에 집중 연구에 특히 적합하다.

우리는 최근 develo의이PED는 ​​따라서 유전 missexpression 연구 ¹ 촉진함으로써이 시스템의 유용성을 넓히고,이 배양 물에서 세포의 고효율 플라스미드 형질 감염을 허용하는 간단한 기술을 특징으로한다. 이 기술의 개발은 세포 자율 방식으로 유전자 기능 연구를 허용하도록 형질의 허용 가능한 수준을 제공 할 방법 과학 문헌에서 보이드로부터 비롯. 일차 배양 신경 ^세포를 형질 ^25,26 악명 하드 때문 부분이다. 이 목적을 위해 이전에 사용 가능한 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 일부는 3-5 % 정도의 효율을 야기하고 상당한 ^독성을 발휘 ^27-32 예컨대 리포 펙션, 칼슘 포스페이트 – 매개 된 형질 전환과 같은 화학적 형질 전환 방법을 포함. 효소 리포터 플라스미드 시스템의 사용은 신호를 증폭하여 불량한 형질 감염 효율의 문제를 피할 수있다하더라도, 그들은하지셀 고유의 효과를 판별하고, 그 결과 전체를 대표하지 않을 작은 세포군에 기초한다. 병아리에서 널리 사용되는 또 다른 방법은, RCA 단자 바이러스 감염은 세포 증식에만 적용이 망막 일차 배양 시스템 ^(33), 따라서 적합하지 않다.

현재 프로토콜에서 배아 병아리 눈 단계 27 (ED 5), 망막 색소 상피 (RPE)를 제거하고, 망막 컵이 플라스미드를 함유 용액으로 가득 전기 챔버에 배치에서 적출 및 사용하여 전기 천공되는 주문 제작 표준 기술 ^(21)을 이용하여 망막 해리와 문화를 이어 전극. 이 절차를 최적화 한 결과의 생존과 분화 특성을 손상시키지 않고 지속적으로 배양 세포 단독 감광체 인구 내의 25 %의 총 수의 22 % 정도의 형질 전환 효율을 달성 할 수 있었다문화 ^1. 여기에서 우리는이 기술의 성공과 재현성을 보장하기 위해이 절차의 모든 중요한 단계를 요약 한 상세한 프로토콜을 제공합니다.