L'induction de la protéine de suppression Grâce<em> In Utero</em> Électroporation à Définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques

La migration radiale est un processus au cœur du développement cortical précoce. Il dépend de divers facteurs autonomes portables, tels que sortie correct mitotique et la différenciation neuronale, la polarité cellulaire, régulation de la dynamique du cytosquelette et l'expression de récepteurs transmembranaires, ainsi que des facteurs autonomes non cellulaires, tels que la formation de l'échafaudage gliale radial et la sécrétion d'orientation migratoire molécules ^1-3. Depuis la perturbation de l'un de ces mécanismes peut nuire à la migration neuronale dans un modèle de souris transgénique ^4-8, déterminer la cause sous-jacente d'un défaut dans la migration peut être un processus complexe et difficile. In utero électroporation (IUE) peut être utilisé pour compléter et simplifier interprétation du phénotype d'un modèle knock-out génétique et donc à élucider les mécanismes importants nécessaires pour la migration radiale ^7,9-11.

In utero électroporation (IUE) est le processus par lequel un plasmide carryi ng à la fois un gène d'intérêt et un rapporteur est injectée dans le ventricule du cerveau d'un embryon de souris ou de rat, puis aspiré dans les cellules qui tapissent le ventricule par l'utilisation d'un courant électrique ^14.12. Cela permet à l'enquêteur d'analyser l'effet de haut ou le bas régulation d'un gène d'intérêt dans le développement ou la fonction des neurones électroporation. Après IUE, cerveaux peuvent être traitées pour l'immunohistochimie ^7,9-11, électrophysiologie ¹⁵ ou culture cellulaire ^16,17. L'avantage majeur de l'IUE est qui est permet une manipulation très spécifique de l'expression génique. En outre, IUE peut être utilisé pour cibler une région spécifique du cerveau en développement à travers un courant dirigé (Figure 2). IUE peut également être utilisé pour cibler un type cellulaire particulier par l'injection des plasmides portant des gènes sous le contrôle de différents promoteurs ou des systèmes d'activation de plasmide (tetracycline induit l'expression du gène est un exemple) ^10,18-21.

jove_content "> IUE peut être utilisé en conjonction avec le système d'excision à médiation par le gène Cre-Lox ^7-9,11,22. Un plasmide contenant un gène codant pour la transmission pour la protéine Cre peut être une électroporation dans des embryons homozygotes pour l'allèle floxé ( dans lequel les régions de gènes ou d'ADN spécifique sont flanquées par deux sites loxP pour la Cre médiation par recombinaison de l'ADN). Cre alors induire une recombinaison du gène d'intérêt spécifiquement dans des précurseurs neuraux électroporation, la génération d'un knock-out de la floxée allele.The effet de protéines knockdown sur la migration neuronale et le développement dans les neurones individuels peut alors être étudié. électroporation de Cre induit recombinaison que dans une petite population de cellules touchées, laissant l'environnement soutien intact. En revanche, expression tissulaire spécifique de Cre sous le contrôle d'un type spécifique de cellules promoteur, se produit tout au long de l'ensemble du tissu de sorte que les deux neuroblastes en migration et le milieu environnant pourraient être affectées. Ainsi, juxtaposition de ces deux approches peut déterminer si un défaut de migration donné est due à la cellule mécanismes non autonomes ou autonomes cellulaires. Migration défectueux dans les deux systèmes expérimentaux suggèrent que les résultats de phénotype observé à partir d'un mécanisme autonome de cellules; migration normale après électroporation avec Cre de migration défectueux dans un modèle Cre spécifique des tissus indique que le gène d'intérêt agit par l'intermédiaire d'un mécanisme autonome non-cellulaire.

IUE peut également être utilisé pour effectuer des expériences de sauvetage par électroporation gènes interagissent potentiels en assommer les animaux ^7,9,10. Par exemple, un enquêteur pourrait tenter de sauver un phénotype de migration dans un modèle transgénique par électroporation d'une cible en aval et de déterminer si le défaut de migration est corrigé dans les neurones électroporation. Ceci présente l'avantage supplémentaire que un sauvetage réussi indique que la migration normale peut être restaurée en manipulant l'expression des protéines dans une SPEneurone cifique, bien que le milieu environnant est encore déficiente pour le gène ciblé. Encore une fois, cette approche est plus de temps et plus rentable que de traverser ou de générer des lignées transgéniques, avec l'avantage supplémentaire de déterminer si le mécanisme défectueux est une cellule autonome.

IUE peut être utilisé pour suivre la migration des neurones par électroporation d'un plasmide rapporteur dans assommer embryons (Figure 4C). Comme seuls les neurones qui tapissent le ventricule au moment de la chirurgie sont électroporées ^17, IUE peut être utilisé pour suivre les neurones nées à un moment précis avec l'avantage de la visualisation de la morphologie in vivo.

Enfin, il est possible d'utiliser IUE pour cibler des régions cérébrales telles que le télencéphale dorsal medial ou, de l'hippocampe ou de l'éminence ganglionnaire (figure 2). Cela donne chercheurs le pouvoir d'enquêter fonction du gène dans une zone spécifique indépendant de complications Résultattion de protéine knockdown dans des structures voisines.

protéine du rétinoblastome (PRB), p107 et p130 comprennent la famille des protéines de poche et sont des régulateurs de la sortie du cycle cellulaire bien établie. Cependant, il ya plus de preuves que ces protéines régulent également cycle cellulaire aspects indépendants du développement neuronal. Comme nous l'avons montré précédemment, PRB et p107 jouent un rôle crucial à la fois tangentielle ^4,23 et la migration radiale ^6. Ici, nous démontrons le rôle des protéines de poche membres de la famille pRb et p107 sur la migration neuronale ⁶ pour illustrer l'utilisation de électroporation in utero de Cre dans un modèle transgénique. En résumé, IUE fournit un moyen puissant d'analyse des effets de cellules autonomes de délétion du gène (ou la surexpression). Lorsqu'il est combiné avec tissu spécifique assommer modèles, IUE peut fournir des informations supplémentaires concernant les mécanismes de contrôle de la migration neuronale.