The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.
Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.
성상 세포는 뇌의 유비쿼터스와 풍부한 신경 교세포 있습니다. 그것은 잘 성상 세포가 중요한 지원 및 세포 외 공간에서의 K + 농도의 버퍼링, 흡수 신경 전달 물질의를 제공 할뿐만 아니라 영양소를 포함 항상성 역할을 역할을한다는 설정됩니다. 그러나, 최근의 연구들은 또한 자연적으로 발생하여 신경 세포의 활동을 1 증가 [칼슘] 내가 신호를 표시하는 것을 알 수있다. 성상 세포의 존재는 [칼슘 2+] I 시그널링 점점 뉴런과의 통신을 유발하는 것으로 생각되고 있으며, 이와 같이 성상 내의 "칼슘 흥분성"의 형태로 해석되었다. 지난 20 년 동안 사용할 수있는 데이터는 성상 세포와 신경 세포는 아마도 양방향 방식으로 통신 할 수있는 두 가지 설정을 제안한다. 첫째, 성상 세포는 종종 내가 신경 전달 물질에 의해 활성화 [칼슘]의 증가로 응답신경이 해제 신경 조절. 둘째, [칼슘 2 +] 성상 세포 내에서 내가 증가는 다시 신경과 혈관에 영향을 미칠 수있는 성상 세포에서 신호 전달 분자의 방출을 야기한다. 증거는 성상 세포에서 방출 분자가 성상 세포 간 신경 신호를 통해 시냅스 회로와 궁극적으로 행동 3-5의 기능의 변화로 이어질 것이 좋습니다. 그러나이 급속히 발전 연구 분야 남아 있고, 이는 성상 세포의 더 상세한 이해는 [칼슘 2+] I는 현재의 불확실성 (6)의 일부를 해결하기 위해 필요하다고 주장하고있다.
과거의 연구에서,이 성상 세포에 유기 칼슘 지표 염료의 대량로드가 확실하게 감지하지 못하는 것을 증명했다 [칼슘 2 +] 문화 및 현장 7-10에서 전체 성상 세포 내에서 내가 신호. 이러한 연구 결과는 우리와 다른 사람 6,11,12에 의해 논의되었다. emerginG 사진은 [칼슘 2 +] 나는 신경과 혈관과의 상호 작용에 대한 기본 사이트입니다 성상 세포 프로세스 (예를 들면, 지점 및 branchlets) 내에서 신호를 거의 자세히 살펴되어 있지 않은 것입니다. 최근에는 세포질 GCaMP3, GCaMP5G 및 GCaMP6 및 세포막과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 사용이 닿는 버전 (예를 들어, Lck에-GCaMP3)는 성상 세포 등의 작은 구획에 [칼슘] 내가 신호의 연구를 허용하고있다 얇은 프로세스, 세포막 근처 전체 지역 7,8 내. 그러나 GECIs 유기 칼슘 2 + 지표 염료를 통해 한 가지 단점을 가지고 GECIs 적절하게 할 표현하는 유전 적 방법은 주 단위로 생체 내에서 성상 세포에 선택적으로 인코딩 유전자를 전달하기 위해 그 요구 사항입니다. 생체 내에서 발현은 일반적으로 노크에 쥐 또는 바이러스를 기반으로 배달 응용 프로그램과 함께, 형질 전환 마우스를 사용하여 달성된다바퀴벌레. 본 조브 기사에서 우리는 아데노 – 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상 세포에 GECIs을 제공하기 위해 사용되는 방법과 절차를보고합니다. 우리는 예를 들어 사이토-GCaMP3에 초점을 동일한 기본 절차는 다른 GECI 또는 형광 단백질 기반 기자 모든 작동합니다.
여기에 설명 된 방법은 우리가 현장에서 후속 [칼슘 2 +] 나는 영상을 위해 생체 내에서 선조체의 성상 세포에서 사이토-GCaMP3을 표현 할 수있다. 이 방법은 형질 전환 또는 강력한 대상 단백질, 신속성의 표현과 실험적인 구현 및 해부학 적 특이성의 유연성을 포함 노크에서 마우스를 사용하여보다 이점이있다. AAV2 / 5 사용 GCaMP3의 발현은 구체적이고 강력한 것으로 밝?…
The authors have nothing to disclose.
대부분의 작업과 관련된 인력은 NIH 보조금 NS060677에 의해 부분적으로 NIH가 MH099559과 (BSK에) MH104069 부여에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 CHDI 재단에 의해 지원되었다.
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
I mL syringe | BD | 309628 | |
syringe needle | BD | 305109 | |
AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
Mounting Medium | Vector | H-1000 |