Neural netthinnen av en mus i alderen 8 dager er på toppen av en 4% gelatin blokk. Etter isolering av det fotoreseptoren lag (200 um) ved vibratome, blir fotoreseptorene utsådd etter mekanisk og enzymatisk dissosiasjon for kulturen. Fotoreseptoren sjikt kan brukes til molekylære, biokjemiske analyser eller transplantasjon.
Netthinnen er en del av det sentrale nervesystemet som har organisert arkitektur, med nevroner i lag av fotoreseptorene, både staver og tapper som er i kontakt med den retinale pigmentert epitelet i den fjerneste del på retina vurderer lysretningen, og den ganglion celler i den mest proksimale avstand. Denne arkitektur gjør isoleringen av fotoreseptoren laget ved vibratome snitting. Dissekert nevrale netthinnen av en mus i alderen 8 dager er flat-embedded i 4% gelatin på toppen av en bit av 20% gelatin fotoreseptoren lag vendt ned. Ved hjelp av en vibratome og en dobbel edged barberblad, er 100 mikrometer tykt indre netthinne seksjoneres. Denne delen inneholder gangliecellene og det indre lag med særlig de bipolare celler. En mellomliggende seksjon av 15 um blir forkastet før 200 pm av den ytre retina som inneholder fotoreseptorene gjenvinnes. Gelatinen blir fjernet ved oppvarming til 37 ° C. Biter av ytre laget er incubated i 500 ul av Ringers løsning med 2 enheter av aktivert papain i 20 minutter ved 37 ° C. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 500 ul 10% føtalt kalveserum (FCS) i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), blir deretter 25 enheter av DNAse tilsatt før sentrifugering ved romtemperatur, vaskes flere ganger for å fjerne serum, og cellene resuspenderes i 500 ul DMEM og utsådd på en 5 x 10 celler / cm2. Cellene er vokst til fem dager in vitro og deres levedyktighet scoret bruker levende / død analysen. Renheten av kulturen bestemmes først ved mikroskopisk observasjon i løpet av eksperimentet. Renheten blir deretter validert ved såing og fikse celler på en histologisk lysbilde og analysere ved hjelp av en kaninpolyklonalt anti-SAG, en fotoreseptoren markør og mus monoklonalt anti-RHO, en stang fotoreseptor spesifikk markør. Alternativt kan fotoreseptoren lag (97% stenger) brukes for genet eller proteinet uttrykket analyse og for transplantasjon.
Netthinnen er en integrert del av sentralnervesystemet som har en arkitektur konservert blant virveldyr. Nevronene i neurale netthinnen er organisert i lag, med den mest fjerntliggende for det innfallende lys, fotoreseptoren sjikt i nær kontakt med den retinale pigmentert epitel (RPE) på baksiden av øyet. Stang og kjegle photorecptors er lyssensitive celler som er avhengige av opsin sensitive molekyler for foton fangst. Disse molekylene er omsluttet på disk membraner av en cellestruktur, som ligger på den ytre del av fotoreseptoren, som peker i retning av RPE 1. Denne strukturen, som er oftest påvirket veldig tidlig i tilfeller av fotoreseptorlidelser degeneration, fornyes med en hastighet på 10% hver dag. Den såkalte indre lag inneholder de fleste av de andre neuroner som beregne det signal som mottas fra fotoreseptorene, bipolar, amacrine og horisontale celler, så vel som gangliecellene. Disse sistnevnte med sine axonerdanner en bjelke som er den optiske nerven. Denne lagdelingen er så konservert at biologer har brukt begrepet fortrengt amacrine celler når cellene er funnet utenfor den indre plexiform lag 2. Lag av nevroner er fordelt i en armatur av radial Müller gliaceller. Bipolare celler knytte fotoreseptorene til ganglion celler. De er plassert mellom det ytre plexiform lag og det indre lag plexiform. Ganglion-celler danner den indre plexiform sjikt i forbindelse med de bipolare celler. De amacrin cellene er navngitt som foreningen celler lokalisert i indre plexiform lag mellom bipolare celler og ganglion celler. Den ytre plexiform laget inneholder horisontale celler. Denne unike arrangement av neuronal lag av sentralnervesystemet tillater isolering av fotoreseptoren lag fra den indre cellelaget ved å skjære den flate montert hinnen ved hjelp av en vibratome.
Opprinnelig ble denne teknikken brukt til å isolere fotoreseptorene for transplantation i øyet av RD1 mus, en modell av menneskelig retinitis pigmentosa (RP) 3. Den RD1 mus bærer en recessiv mutasjon i Pde6b genet som koder for det stav-spesifikke fosfodiesterase-beta-underenhet. Recessive mutasjoner av dette genet resultat i RP hos mennesker fire. Etter stang fotoreseptorene har utartet, mister pasienten nattsyn, og overraskende kjegle fotoreseptorer, som ikke uttrykker det muterte genet, utarte som et neste trinn. Fordi kjeglene er nødvendig for fargesyn og synsskarphet, pasientene blir gradvis blind og en effektiv behandling for sykdommen har ennå ikke utviklet. Ved poding av fotoreseptoren sjikt fra en villtype-mus konusen degenerasjon av vertmusen forsinkes 3,5. Stavene tapt i stav kjegle degenerative modell kunne ikke erstattes av et transplantat, fordi den synaptiske forbindelsen mellom stang og bipolare celler kan bare oppnås ved en bestemt fase av retinal utvikling, preget av utbruddet av NRL uttrykk seks. Sjiktet av fotoreseptorene er innført ved operasjon i sub-retinal plass av stangen mindre RD1 retina, RPE og mellom den ytre retina svarende til bare 3% av de gjenværende fotoreseptorer, kjeglene. To uker etter kirurgi, 40% av kjegler fra dyr transplantert med en vanlig fotoreseptoren lag overlevde i forhold til dyr transplantert med et normalt indre lag av netthinneceller, eller til sham-opererte dyr. Topografien kjegle overlevelse, spredt ut over hele overflaten av det muterte retina plassert ved posisjonen av den podede vev viser at den beskyttende effekt skyldes en diffunderbart molekyl 7.
Deretter vi brukt et ko-kultursystem, så vel som kondisjonert kulturmedium for å validere det faktum at den beskyttende effekt er avhengig av sekresjon av et protein ved hjelp av stenger 8,9. Vi hypotese at dette proteinet vil bli expressed kontinuerlig og spesielt av stenger og at deres død i løpet av første fase av sykdommen vil utløse sekundær kjegle degenerasjon av tapet av en beskyttende signal fra stenger i et ikke-celle autonome måte 10. På grunn av viktigheten av kjeglen mediert sentrale synet hos primater denne antatte proteinet vil være en svært relevant terapeutisk verktøy for RP. Bevare de kjeglene i RP ville teoretisk hindre totalt 1,5 millioner pasienter over hele verden til å bli blind 11. Vi har brukt et høyt innhold screening tilnærming og en kjegle-beriket kultur modell for å identifisere et cDNA som koder for Rod-avledet Cone Livskraftig Factor (RdCVF) fra en retinal cDNA bibliotek 12. RdCVF er skjøtt produkt av NXNL1 gen som er interessant homologt til genet som koder for proteiner involvert i tioredoksin redoks-homeostase 13. Den andre skjøtes produkt av genet, er RdCVFL et enzym som beskytter sitt mål, Tau-protein mot oksidativ dAmage 14. Administrasjon av RdCVF hindrer sekundær degenerasjon av kjegler og tapet av sin visuelle funksjon i en recessiv, og dominerende modellen av RP 12,15. Dette viser to viktige aspekter ved denne innovative terapeutisk strategi 16. For det første kan den anvendes i de fleste tilfeller RP i et gen-uavhengig måte. For det andre er i strid med konkurrerende faktor CNTF, RdCVF overlevelse i forbindelse med vedlikehold av synsfunksjon 17. Fraværet av funksjonelle effekten kan forklare årsaken til fravær av klinisk nytte av forvaltningen av CNTF til RP pasienter 18. RdCVF er mest sannsynlig en av de viktige overlevelse signalet mellom stenger og kjegler siden kjegle redning in vitro hemmes av RdCVF immunodepletion 12. I tillegg til avbrudd av den stang avledet kjegle levedyktighet genet fører til fotoreseptoren dysfunksjon og mottakelighet for oksidativt stress 19.
Anvendelse avfotoreseptoren laget er på opprinnelsen til identifisering av RdCVF og av en roman Redox signal involvert i nevrodegenerative sykdommer 20. Dette manuskriptet beskriver protokollen som brukes for å isolere og dyrke celler fra fotoreseptoren lag for å karakterisere aktiviteten av RdCVF. Fotoreseptorene kan opprettholdes i kultur for 5 til 7 dager 21. Denne teknikken kan også brukes til å studere ekspresjonen av spesifikke gener fotoreseptoren.
Netthinnen er en modell organ i biologi. Studie av netthinnen førte til seks store funn i biologi. Det er på opprinnelsen til den første tumorsuppressorgen RB1. Det avslører den molekylære koblingen mellom reseptortyrosinkinaser og kartet kinaser gjennom interaksjon med Sønn sevenless. Det var involvert i oppdagelsen av Pax6, den første master kontroll genet for orgel morphogenesis. Det er i sentrum av den genetiske sammenslutning av komplementfaktor H (CFH) med aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), den første sykdom mottakelighet genet identifisert av genomet omfattende forening skjerm (GWAS). Til slutt, det førte til den første vellykkede genterapi for Leber medfødt synstap, den første korrigerende genterapi rettssak i menneskets av noen arvelig sykdom. Strukturen av dette organ er konservert i de fleste virveldyrarter. Sin tilgjengelighet for manipulasjon in vivo har oppmuntret tidlig på funksjonell genomikk undersøkelser på dette integrert del av øreRAL nervesystemet.
Vi viser her hvordan å skille fotoreseptoren lag fra det indre laget av netthinnen ved vibratome snitting. Dette trinnet er kritisk for å oppnå rene kulturer fotoreseptoren. Vår disseksjon protokollen gjør forurensning av RPE cellene svært usannsynlig.
En av de store utfordringene er flatere av netthinnen som er nødvendig § ordentlig den indre og den ytre netthinnen. Snitte av netthinnen er best på retina med liten diameter som de fra gnagere, og denne diameter er en begrensning av teknikken med nåværende tilgjengelig materiale.
Det er tilrådelig før du starter et biologisk menings eksperiment, for å øve på en prøve av netthinnen. Vi illustrerer fremgangsmåten ved representative resultater oppnådd fra dyrkede fotoreseptorcellene, ved hjelp av materialet til å utføre ekspresjon studie av både mRNA og proteiner. Ekspresjonsstudier kan også utføres alternativt på sections innhentet av laser capture mikrodisseksjon, men kulturene er best utført ved hjelp vibratome snitting. Vi kunne ha benyttet teknikken med mikrodisseksjon laser med en fullstendig forskjellig strategi. Men, for å samle den fotoreseptoren lag med mikrodisseksjon apparat for kultur, ville det være nødvendig for å unngå fiksativ, og dette ville vanskeliggjøre strøm metodikk betydelig.
Vi utvikler en protokoll som tar sikte på å studere kinetikk av gen- og proteinuttrykk i vibratome avsnittene under degenerasjon av fotoreseptorene i modeller av retinitis pigmentosa. Vi tror at den detaljerte beskrivelsen av protokollen vil være nyttig for forskere innen retinal biologi, og mest spesielt for proteomikk og metabolomic studier.
The authors have nothing to disclose.
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
Scissor | Moria | 15396-00 | |
Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
* Supplements |