Een<em> In Vitro</em> Adult Mouse spier-zenuw Voorbereiding voor het bestuderen van de Firing Eigenschappen van Muscle afferenten

Passende nationale en institutionele ethiek moet worden verkregen voordat dierproeven. 1 Verwijdering van EDL Spier en Nerve Weeg en diep verdoven een volwassen muis met geïnhaleerde isofluorane met een verdamper met 5% isofluorane plus een 1,5 L / min zuurstof stroomsnelheid of een stolp met isofluorane gedrenkt katoen aan de onderzijde. Zorg ervoor dat de muis is diep verdoofd en niet reageert op een teen knijpen. Snel onthoofden met behulp van grote, geslepen schaar of een guillotine. Maak een ventrale middellijn snede door de ribben met een schaar en verwijder de interne organen. Huid van het dier door het grijpen van de huid van de nek en het verleden van de voeten te trekken. Verwijder de benen door het snijden boven de heupen en plaats de huid benen in een schaal met gekoelde (4 ° C), carbogenated (95% O2, 5% CO2) laag calcium, hoog magnesium bicarbonaat gebufferde zoutoplossing containing in mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2PO 4, 26 NaHCO3, 0.85 CaCl2, 6,5 MgSO4 en 10 glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. De lage calcium, magnesium hoge oplossing remt synaptische transmissie tijdens de dissectie. Leg de benen dorsale zijde naar boven in de schaal en speld de benen en heupen naar beneden met behulp van naalden of insect pinnen, zodat de knie-en enkelgewrichten zijn in een hoek van 90 °. Plaats een pin op elk uiteinde van de voeten en een pin op elk van de voorste en achterste dijen om het weefsel op zijn plaats te houden. Met Castroviejo spring schaar, til de bovenste spierlaag op de dijen en een middellijn gesneden om de heupzenuw direct onder blootstellen. De heupzenuw ligt net onder de bovenste spierlaag en loopt boven de femur van de uitgang bij de heupen tot het vertakt in de gemeenschappelijke peroneale en tibialis net voor het kniegewricht. Verwijder de spier boven de heupzenuw totdat de point waarop de diepe peroneus tak duikt in de flexor hallucis longus (FHL) spier zichtbaar is. Gebruik # 55 tang, ontleden het bindweefsel rond de peroneale branch te bevrijden van de gastrocnemius en soleus spieren, die op de mediale zijde van de tibia. Snijd de pezen van de gastrocnemius en soleus spieren los en verwijder voorzichtig van onder de zenuw. Verwijder de oppervlakkige spier aan de laterale zijde van de tibia drie verschillende pees bundels ondergaan bij het enkelgewricht-van mediaal naar lateraal: FHL, EDL en tibialis anterior (TA), met de EDL verborgen onder de TA. Snijd de TA pees aan het enkelgewricht, tilt u de TA omhoog en weg van de EDL, en snijd de spier in de buurt van de knie om het te verwijderen. Snijd de FHL pees aan de enkel en til het terug naar het gebied waar de zenuw komt in de FHL bereiken. Juist onder dat punt en verwijder ~ 2/3 van het FHL spier. Snijd de heupzenuw zo dicht mogelijk bij het heupgewricht als poswoordelijk en voorzichtig ontdoen van alle zenuw takken behalve de diepe peroneale tak. Snijd de EDL pezen op zowel de enkel-en kniegewrichten met grote veer schaar. Met behulp van een scherpe schaar, verwijder de EDL, de resterende FHL en zenuwen van het omringende weefsel door te snijden door de tibia bot bij de knie en halverwege de dij. Knip de resterende tibia bot zodat enkel de EDL, een deel van de FHL en zenuw blijven. 2 Montage van de EDL spier en zenuw in de Tissue bad (figuur 1A) Voor de start van het experiment bereiden weefselbad. Voortdurend perfuseren het bad met zuurstof (100% O2) synthetische interstitiële vloeistof (SIF) bevattende (in mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO4, 1,7 NaH 2PO 4, 2,0 CaCl2, 9,5 NaCl 6 H 11 O ( natriumgluconaat), 5.5 glucose, sucrose 7,5, en 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N '-2-ethanesulfonic zuur (HEPES); pH 7.4 ± 0.05 17. Een stroomsnelheid van 15-30 ml / min wordt aanbevolen. Getoond wordt een commercieel verkrijgbaar bad van 25 ml met twee stimuleren de bodem van het bad, een gemonteerde tissue post en een steun voor een kracht en lengte controller (approximate bad vaste afmetingen elektroden 8,5 cm x 3 cm x 1 cm, voor specificaties zie tabel van Materialen / Equipment). Gebruik de resterende FHL weefsel om de geïsoleerde spier-zenuw moet plaatsen en het in het weefsel bad. Plaats een klein stukje van Sylgard op de bodem van de schaal en gebruik een insect pin door de resterende FHL weefsel om de spier te stabiliseren. Gebruik 6-0 zijde hechtingen aan beide pezen te binden en aan te brengen een einde te maken aan het weefsel post en de andere aan de arm van de kracht en de lengte-controller (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor specificaties). Gebruik de kleinste hechtdraad lengte die praktisch. Verwijder het insect pin en Sylgard nadat u de pezen hebben vastgebonden. OPMERKING: Om te zorgen voor een eenvoudigeverbinding met de hefboomarm een ​​klein stuk draad kan worden gebogen in een "j" vormige haak en bevestigd in de hefboomarm met epoxy. De hechting kan dan op de draad worden gekoppeld in plaats van schroefdraad in het gaatje van de hefboomarm. Maak zuigkracht elektroden van SA 16 glas door eerst met behulp van een glazen micropipet trekker (Warmte = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Tijd = 200); breek het topje heen en handmatig slijpen het op een slijpsteen tot er ongeveer een 3 mm conus. Smelt de spuitkop en een microforge om het gewenste punt binnendiameter van tussen de 10-100 micrometer afhankelijk van het gebied van de zenuw die men wenst te proeven van (zie figuren 1B-1C voor elektrode-schema en de tabel van Materialen / Apparatuur voor productinformatie). Vul een premade glas zuig-elektrode om de innerlijke zilverdraad met SIF. Zuig het afgesneden uiteinde van de zenuw in de elektrode en op de positief haven van een verschilversterker. Wikkel de elektrode met een gechloreerde zilverdraad die wordt aangesloten op de negatieve aansluiting van de headstage. Aard de SIF bad door het uitvoeren van een tweede gechloreerde zilveren draad van het bad aan de grond-poort van de headstage's. Ook de grond van de perfusie slang aan op de kooi van Faraday op meerdere punten aan elektrische ruis geïntroduceerd via de perfusie pompen te beperken. Stimuleren spier via de elektroden aangebracht aan weerszijden van de spier in het weefselbad een twitch contractie te induceren. Anderzijds plaatst een stimulerende elektrode op het afgesneden uiteinde van de zenuw. Verhoog de stimulerende spanning tot een piek contractiekracht wordt waargenomen en verhoog de spanning met nog eens 15% tot supramaximale spanning (0,5 msec pulsbreedte) bereikt. Verdere twitch contracties bij supramaximale spanning met een 10 seconden rust tussenin, maar varieert de lengte van de spier tot een piek samentrekkingskracht wordt bereikt om de optimale lengte (Lo) van de spier vinden. Alle lengte ramps en trillingen zal beginnen met de spieren in deze lengTh. Laat de spier-zenuw bereiding in het bad gedurende ten minste 1 uur voor verder gegevensverzameling om het weefsel de badtemperatuur te bereiken en voor normale synaptische transmissie te herstellen na dissectie in een lage calcium oplossing. Om gegevens te verzamelen op een andere dan de kamertemperatuur temperatuur, plaats een temperatuursensor in het weefsel bad in de buurt van de spier. Langzaam breng het bad op temperatuur door het pompen verwarmde water via weefselbad basisplaat. Wikkel klei microwavable verwarming pads rond de SIF reservoir voor het behoud van een stabiele temperatuur. 3 Data Collection Om een ​​afferente identificeren als een spindel afferente, noteer de neuronale activiteit tijdens herhaalde twitch contracties geproduceerd door een 0,5 msec supramaximale spanning stimulans geleverd eenmaal per seconde. OPMERKING: Muscle spindle afferentia moet pauzeren tijdens de twitch samentrekking 18,19 (figuur 2). Gebruik data-acquisitie software op lengte wijzigingen toe te passen op verschillende snelheden en in verschillende lengtes. Gebruik een aangepast script om deze taak te automatiseren (zie aanvullende informatie voor een screenshot van het script en aanwijzingen over hoe de stukken gegeven aanpassen). Breng ramp-and-hold stukken 4 sec bij stuk lengte van 2,5%, 5% en 7,5% L o en rek snelheid van 20, 40 of 60% L o / sec 15. OPMERKING: Zie de handleiding voor specifieke kracht en lengte controller voor nodig voltage-to-millimeter omrekeningsfactor. Na afloop van het experiment bepalen spieren gezondheid bij 24 ° C met maximale isometrische tetanische contracties (500 msec train, 120 Hz frequentie van treinen, 0,5 msec pulsbreedte, supramaximale spanning). Vergelijk de piek contractiekracht met eerder gerapporteerde waarden (~ 24 N / cm 2 9,20).