Bir<em> İn Vitro</emKas afferentlerin tahrik Properties incelenmesi için> Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık
Summary
Kas duyusal nöronlar propriyoseptör sinyalizasyon dahil ve aynı zamanda metabolik devlet ve yaralanma ile ilgili olaylar üzerine rapor edilmektedir. Biz streç aktive kas afferentlerde çalışmaları için in vitro kas-sinir hazırlanmasında bir yetişkin fare açıklar.
Abstract
Kas duyusal nöronlar, kas iğ ve Golgi tendon organlarının Propriosepsiyon için gerekli uzunluk ve kuvvet değişiklikleri kodlamak innerve. Ek afferentleri metaboliti birikinti, sıcaklık, ve nosiseptif uyaranlara dahil kas çevrenin diğer özellikleri, izlemek. Genel olarak, duyusal nöronların aktivasyonu anormal hareket bozukluğu olan veya kronik ağrı sendromlara neden olabilir. Biz, erişkin farede esnetilebilir-uyarılmış aferent yanıtların in vitro çalışma için ekstensor digitorum longusun (EDS), kas ve sinir izolasyonunu tarif eder. Duyu aktivitesi, emme elektrodu ile sinirinden kaydedilir ve tek tek ileticileri başak sıralama yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. In vitro preparasyonlar anestezi potansiyeli karıştırıcıların veya değiştirilmiş kas perfüzyon olmadan duyu ileticilerinin üzerinde iyi kontrol edilen çalışmalar için izin verir. İşte biz belirlemek ve germek için kas iğ afferentlerinden tepkisini test etmek için bir protokol açıklar. Önemli bir şekilde,Bu hazırlık da ilaç uygulama ve farelerde güçlü genetik yaklaşımlar ve hastalık modellerinin dahil aşağıdaki kas afferentlerin, tepki özellikleri diğer alt tiplerinin çalışmasını destekler.
Introduction
İskelet kasları, kas ortamı hakkında önemli bilgiler merkezi sinir sistemi sağlamak duyu nöronlar tarafından innerve. Kas iğ yüksek ekstrafüzal kas lifleri ile paralel olarak yer alan intrafüzal kas elyaflardan oluşan kapsül yapılardır. Iğ Grup Ia ve kas uzunluğu ve intrafüzal lif tonunda değişiklikler dinamik innerve gamma motor nöronlar 1 tarafından düzenlenir kodlamak II aferentler tarafından innerve. Grup Ib afferentler kas lifleri ve onların tendon yapışma arasına konumlandırılmış ve kas kasılmasının 2 sırasında örneğin kas kuvveti değişikliklere duyarlı olan. Grup Ia, Ib ve II afferentler uygun motor kontrolüne yardımcı proprioseptif geribildirim sağlamak. Kas içinde bulunan kas ileticilerin ilave popülasyonlar (Grup III ve IV) metabolit oluşumunu, nosiseptif uyaranın varlığını ve kas sıcaklık sinyal vermektedir <sup> 3. Bu kas duyusal bilgi vücut dengesinin sürdürülmesinde kas hasarı önlemek ve hareketi modüle etmek önemlidir. Kas afferentler önceden tecrübesi 4 dayanarak ateş desenleri değiştirebilir. Nosiseptörlerin aktivasyonu dengesi ya da hareket 6 ile ilgili problemlere neden olabilir kronik ağrı halleri 5 ve kas algılayıcılardan gelen anormal sinyallemesinin indüklenmesine yol açabilir. Biz (de gösterilmiştir 2-4 ay eski C57Bl / 6 farenin ve yanıtları) Her iki cinsiyetten yetişkin farelerin kas duyusal nöron reseptör sonlardan tepkisini incelemek için in vitro hazırlanmasında izole kas-sinir kullanın. Fare memelilerde çalışmalar için bir model genetik türdür. Bu preparat, siyatik sinirinin derin peroneal dal ve ekstensör digitorum longus (EDS), kas, alt bacağın yan kısmında bulunan peroneal grubunun bir hızlı kasılan kasın izole edilmesini gerektirmektedir. EDL genellikle kas kasılma özellikleri 7-9 incelemek için kullanılır, te vardırkolay ndons yalıtmak ve istirahat ve makul daralma görev çevrimleri 10 ile yeterli dağılır oksijen kaynağı sağlayacak kadar küçüktür için. (Örneğin soleus ve tibialis anterior için) bu alanda diğer kaslar benzer bir boyutu vardır ve bu hazırlık kolayca bu kasların aferentler kayıt için değiştirilmiş olabilir. Bir emme elektrodu kas duyu ileticisi, ateş kaydetmek için sinirin kesik ucuna yerleştirilir. Bireysel nöronlar tespit ve başak sıralama yazılımı kullanarak kendi başak şekline göre analiz edilebilir. Banyo ya da sinir üzerinde uyarıcı elektrot kas kasılması uyandırmak için kullanılabilir. Kas uzunluğu ve kuvvet kontrol edilir ve ticari olarak temin edilebilen sistemler kullanılarak ölçülebilir. Benzer nitro preparasyonlar EDS 11 sıçanda t, sıçan dördüncü lumbrikal ayak kas Grup IA ya da II mili ileticileri 12 Grup III ve IV kas ileticileri Grup III ve IV kas ileticileri incelemek için kemirgenlerde kullanılmıştır bölgesindekifare plantar kas 13 diye.
In vitro bir sistem farmakolojik erişilebilirlik sıcaklık ve pH gibi perfüzyon ve fizikokimyasal değişkenler doğrudan kontrolünde avantajları vardır. Bir in vitro yaklaşım, in vivo potansiyel anestezi ve kas perfüzyon durumunun boşa ortadan kaldırır. Kas-sinir hazırlık afferentlerde pertürbasyonunun doğrudan yanıt çalışmaya imkan tanırken, in vivo 14 veya ex 3 preparatlar gibi kurban edilir vivo mümkündür mili duyarlılığı ve diğer entegre cevapların gama efferent modülasyonu çalışma yeteneği Bu hazırlık nöron hücre gövdeleri vardır.
Bu preparasyon, daha önce rampanın bir pile fare kas mili ileticilerin yanıtını belirler ve esneme ve titreşimi tutmak için kullanılır ve bu fare mili iletici yanıt vermeyen belirlendiBu tür malzeme, sıçanlar, kediler, ve insanlar gibi diğer türlerde de rapor edilenlere benzerdi. Fare mili afferent cevapları 34 ° C mutlak atış hızlarında daha hızlı olmasına rağmen, 24 ° C ve 34 ° C banyo sıcaklıkları hem de benzer bulundu ve afferentler 15 değiştirir hızlı uzunluğuna yanıt daha başardık. Bu preparat kas mili ileticileri belirlemek ve incelemek için kullanılabilir nasıl aşağıda açıklanmaktadır. Ayrıca, bu preparat kolayca bir ilaç ya da hastalık durumunun veya çeşitli diğer değişkenler (yaş, cinsiyet, gen nakavt) yanıt olarak duyu ileticilerinin özelliklerini karşılaştırmak için, diğer alt tiplerinin kas iletici 13 tepkisini incelemek için modifiye edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalenin amacı, bir fare izole kas-sinir hazırlık kas iğ afferentlerin kayıt için bir yöntem tarif oldu. Biz fare mili afferentler sıçan, kedi ve insanlarda 15 gelenler gibi germek için benzer yanıt bulduk, ve diğer laboratuarlar kas ve in vitro deride hem de duyusal nöronların çalışma model organizma olarak fareleri kullanmıştır (örneğin 3,13 için) .
Kas duyusal afferentler 24 ° C ve 34 ° C hem de en az 6-8 saat süreyle kaydedilebilir. EDL ve sinir en aza indirmek için, mümkün doku işlemek için FHL kalan bölümünü kullanın. Diseksiyon sonra, organ banyosu sıcaklığında ve normal sinaptik kurtarmak için dengeye gelmesi için yeterli veri toplama başlatmak için en az 1 saat bekletin. Daha önce, kas sağlık maksimal tetanik Contra belirlenmesiyle bu hazırlıkta kullanılır kas bir alt kümesi ile doğrulanmıştırkasları tarafından üretilen kuvvet ctile deney 15'in başında ve sonunda diğerleri tarafından rapor edilene benzer.
Kas mili afferentler (Şekil 3) (Şekil 2) kasılmayı seğirme yanıt ateş karakteristik bir duraklama arıyor yanı sıra uzunluğu değişikliklere yanıt beklenen anlık frekans artışları ile bu hazırlık işlevsel tespit edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, kontrol koşullarında ateş en afferentler kas iğ afferentler vardır. Bu hazırlık (~ 7 mm maksimum) tutulan sinirin uzunluğu kas aferan subtiplerinin 13 tanımlamak için afferent iletim hızı farklılıkları kullanmak için yeterince uzun değildir. Ayrıca, kedi ve insanlarda aksine, dinamik duyarlılık ölçüleri (daha fazla tartışma için Wilkinson ve ark. 15'e bakınız) açıkça farelerde Grup Ia ve II afferentleri ayırt etmek mümkün değildi. Afferentlerin Diğer alt tipleri (yani., Grup III ve IV), vb iskemi kas açığa, banyo pH azaltılması, kapsaisin, ATP veya bradikinin gibi 3,13,21-23 maddeler eklenerek, örneğin, bu terkipte ilave fonksiyonel testler kullanılarak tespit edilebilir Emme elektrodu kullanarak tek bir kas alınabilir veri miktarını arttırır, birden fazla duyusal nöronlardan etkinliği, bir kez kayıt sağlar. Bu hazırlık duyusal nöron nüfus yanıtlar veya tespit afferentlerinden tepkiler üzerine bir pertürbasyonun genel etkisini ölçmek için kullanılabilir. Başak şekiller yeterli benzersiz iseniz, 4 duyu nöronlarının kadar () Spike2 ikisi (Cambridge Elektronik Tasarım) ve LabChart Pro (AD Instruments benzer gerçekleştirdiniz) yazılım tarafından ayırt edilebilir. Nöronlar ayrımcılık olamaz durumlarda, elektrot yerleştirme veya uç çapının değişiklikler kolayca uygulanabilir.
In vitro HAZIRLIK Özet olarak, fare sinir kastirme çeşitli fizikokimyasal tedirginlikler, yaralanma ve hastalık modelleri kas duyusal afferent tepki özelliklerini araştırmak için kullanılan basit bir deneysel yaklaşımdır. Ayrıca, bu preparat ideal transgenik hayvanları ve Optogenetic araçları dahil olmak üzere, farelerde mevcut güçlü genetik araçlar, yararlanmak için uygundur.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Materials
| Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
| Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
| 2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
| Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
| Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
| Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
| Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
| Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
| Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
| Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
| Microforge | Narishige | MF-9 | |
| Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
| 6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
| Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
| Glucose | Sigma | G5767-500G | |
| Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
| HEPES | Sigma | H3375-250G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
Referencias
- Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. Section 1, The Nervous System, Motor Control. Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).
- Houk, J., Simon, W. Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon. J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).
- Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse. J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).
- Nichols, T. R., Cope, T. C. Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes. Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).
- Mense, S. Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain. Pain. 54, 241-289 (1993).
- Proske, U., Gandevia, S. C. The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force. Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).
- Close, R. Force: velocity properties of mouse muscles. Nature. 206, 718-719 (1965).
- McCully, K. K., Faulkner, J. A. Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions. J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Barclay, C. J. Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).
- Taguchi, T., Mizumura, K. Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro. European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).
- Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles. J Physiol. 588, 171-185 (2010).
- Wenk, H. N., McCleskey, E. W. A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia. J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).
- Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors. J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).
- Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation. PLoS One. 7, e39140 (2012).
- Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord. J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).
- Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin. J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).
- Matthews, B. H. C. Nerve endings in mammalian muscle. J Physiol. 78, 1-53 (1933).
- Hunt, C. C., Kuffler, S. W. Stretch receptor discharges during muscle contraction. J Physiol. 113, 298-315 (1951).
- Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hoheisel, U., Reinöhl, J., Unger, T., Mense, S. Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat. Pain. 110, 149-157 (2004).
- Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction. J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).
- Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro. Pain. 151, 744-755 (2010).
