<em> 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구> 성인 마우스 근육 - 신경 준비

적절한 국가 및 기관의 윤리는 동물 실험을 수행하기 전에 확인하셔야합니다. EDL 근육과 신경의 1 제거 무게와 깊이 5 % 이소 플루오 란을 가진 기화기 플러스 1.5 L / 분 산소 유량 또는 바닥에 이소 플루오 란 적신 코튼 벨 항아리를 사용하여 흡입 이소 플루오 란과 성인 마우스를 마취. 마우스가 깊이 마취하고 발가락 핀치에 응답하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 빨리 크고 날카롭게 가위 단두대를 사용하여 목을 벨. 가위를 사용하여 갈비뼈를 통해 복부 정중선 컷을 확인하고 내부 장기를 제거합니다. 목의 영역에서 피부를 잡고 발을지나 당겨 동물 스킨. 엉덩이 위에 절단하여 다리를 제거하고 carbogenated 냉장 (4 ° C)와 함께 접시 (95 % O 2, 5 % CO 2) 저 칼슘, 높은 마그네슘, 중탄산 완충 식염수 용액 contai로 피부 다리를 배치밀리미터에서 닝 : 128 염화나트륨, 1.9의 KCl, 1.2 KH 2 PO 4, 26 탄산 수소 나트륨, 0.85 염화칼슘, 16 6.5 황산, 10 포도당 (7.4 ± 0.05의 pH를). 저 칼슘은 높은 마그네슘 용액 중에 절개 시냅스 전달을 억제한다. 접시에 다리에게 지느러미 측면을 놓고 다리를 고정하고 무릎과 발목 관절이 90도 각도를 이루도록 바늘이나 곤충 핀을 사용하여 아래로 엉덩이. 대신에 조직을 유지하기 위해 각 다리의 끝과 전방 및 후방 허벅지에 각각 한 핀에 핀을 배치합니다. Castroviejo 스프링 가위를 사용하여, 허벅지 근육의 상단에 레이어를 위로 들어 올려 바로 아래 좌골 신경을 노출 잘라 중간 선을합니다. 좌골 신경은 단지 위쪽 근육 층의 아래에 위치 엉덩이 근처의 출구에서 대퇴골 위의 실행 때까지 그냥 무릎 관절 전 비골과 경골 신경으로 분기합니다. 포까지 좌골 신경 위의 근육을 제거INT가되는 굴근 hallucis의 longus (FHL) 근육에 깊은 비골 신경 분기 다이빙 볼 수 있습니다. # 55 집게를 사용하여, 경골의 내측에있는 비복근과 가자미근에서 잘 나오도록 비골 지점 주변의 결합 조직을 해부하다. 비복근과 가자미근 근육의 힘줄을 잘라 조심스럽게 신경 아래에서 제거합니다. TA 아래에 숨겨진 EDL로, FHL, EDL과 전 경골근 (TA) : 공동의 내측 측 방향하기 위해 발목에 세 개의 서로 다른 건 번들을 노출 경골의 측면에서 표면 근육을 제거합니다. , 발목 관절에서 TA 건을 잘라 EDL로부터 멀리 TA 들어 올린 후를 제거하는 무릎 근처 근육을 잘라. 발목 FHL 건 잘라 신경이 FHL을 입력 영역에 도달하는 데 다시 올립니다. 단지 그 시점 아래 잘라 FHL 근육의 ~ 2 / 3를 제거합니다. POS와 고관절에 가깝게 좌골 신경을 잘라sible 부드럽게 깊은 비골 지점을 제외한 모든 신경 가지를 벗겨. 큰 봄 가위를 사용하여 두 발목과 무릎 관절의 EDL의 힘줄을 잘라. 예리한 가위를 사용하여, 무릎 뼈 경골을 절단하여 주위 조직에서 EDL, 나머지 FHL 신경을 제거하고 허벅지를 통해 중간에. 그래서 그냥 EDL은, FHL 신경의 일부가 남아있는 남아있는 경골 뼈를 버려야. 조직 목욕에 EDL 근육과 신경의 2 실장 (그림 1A) 실험을 시작하기 전에, 조직 욕을 준비한다. 지속적으로 목욕을 관류 산소 (100 % O 2) 합성 간질 액 (SIF) 123 염화나트륨, 3.5의 KCl (mm 단위)를 포함, 0.7 황산, 1.7의 NaH 2 PO 4, 2.0 염화칼슘, 9.5 NAC 6 H 11 O ( 글루 콘산 나트륨), 5.5 포도당, 자당 7.5, 10 N -2 – hydroxyethylpiperazine- N '-2 – 동부 표준시hanesulfonic 산 (HEPES); pH가 7.4 ± 0.05 17. 15-30 ㎖ / 분의 유속을 권장합니다. 욕실의 바닥에 장착 조직 포스트와 힘과 길이 컨트롤러에 대한 마운트 (대략 목욕 차원에 고정이 자극 전극을 25 ㎖의 용량이 시중에서 판매하는 목욕은 표시 8.5 cm X 3cm X 1cm, 사양 ) 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 고립 된 근육 신경을 처리하고 조직 화장실로 배치 나머지 FHL 조직을 사용합니다. 접시의 바닥에 실 가드의 작은 조각을 배치하고 근육을 안정 남아있는 FHL 조직을 통해 곤충 핀을 사용합니다. 두 힘줄을 묶어 하나의 조직 게시물에 끝과 힘과 길이 컨트롤러의 레버 암에 다른 부착하는 6-0 실크 봉합사를 사용 (사양 재료 / 장비의 표 참조). 실제 최소의 봉합 길이를 사용합니다. 당신은 힘줄을 연결 한 후 곤충 핀과 실 가드를 제거합니다. 주 : 쉽게 용이하게하기 위해레버에 연결 와이어의 작은 조각은 에폭시와 레버 아암으로 "J"형상 훅으로 절곡하여 고정 할 수있는 팔. 봉합 후, 와이어에 묶여 대신 레버 아암에 작은 구멍에 나사 수있다. 첫번째 유리 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 SA (16) 유리 흡입 전극을 확인 (열 = 286, = 0, 속도 = 150 시간 = 200 당겨); 다시 끝을 중단하고 직접 3mm 테이퍼에 대해있을 때까지 숫돌에 갈기. (전극 제품 정보에 대한 개략적 인 표 재료 / 장비도 1B-1C 참조) 한 표본을 추출하고자하는 신경의 지역에 따라 100 μm의 – 10 사이의 원하는 팁 내경에 microforge를 사용하여 끝 부분을 용융. SIF와 내부 실버​​ 와이어에 들어 찬 유리 흡입 전극을 입력합니다. 전극으로 신경의 절단 단부를 흡입 및 차동 증폭기의 양의 포트에 연결한다. 염화물로 실버 전극을 감싸headstage의 부정적인 포트에 연결 와이어. headstage의 접지 포트에 화장실에서 초 염화물로 실버 와이어를 실행하여 SIF 목욕을 접지합니다. 또한 관류 펌프를 통해 소개 전기 노이즈를 완화하기 위해 여러 지점에서 패러데이 케이지에 관류 튜브를 접지하십시오. 트 수축을 유도하는 조직 욕 근육의 양측에 장착 된 전극을 통해 근육을 자극한다. 또한 신경의 절단 끝에 자극 전극을 배치합니다. 피크 수축력이 관찰 될 때까지 자극 전압을 증가하고 supramaximal 전압 (0.5 msec의 펄스 폭)에 도달하도록 추가로 15 %의 전압을 증가시킨다. 그 사이 10 초 휴식으로 supramaximal 전압에서 트 수축을 계속하지만, 피크 수축력까지 근육의 길이를 변화하는 것은 근육의 최적 길이 (L 오)을 찾기 위해 도달된다. 모든 길이 경사로 및​​ 진동이 LENG의 근육과 함께 시작됩니다일. 근육 신경 제제는 조직이 조 온도에 도달하고 정상 시냅스 전달을 위해 저 칼슘 용액 해부 다음 복구 할 수 있도록 후속 데이터를 수집하기 전에 최소한 1 시간 동안 욕에서 유지하도록 허용. 실온 이외의 온도 데이터를 수집하기 위해, 근처의 근육 조직 욕에 온도 센서를 배치했다. 천천히 목욕 티슈베이스 플레이트를 통해 가열 된 물을 펌핑하여 온도 욕 위로 가져온다. 일정한 온도를 유지하는 데 도움이되는 SIF 저수지 주변에 점토 전자 레인지 가열 패드를 감 쌉니다. 3 데이터 수집 , 스핀들 심성으로 심성을 식별 반복 트 한 번 전달 0.5 밀리 supramaximal 전압 자극에 의​​해 생성 된 수축 모든 초 동안 신경 세포의 활동을 기록합니다. 참고 : 근육 스핀들 심성이 트 수축 (18, 19) (그림 2)를 일시 중지해야합니다. 를 사용하여 다타 수집 소프트웨어는 다른 속도로 서로 다른 길이로 길이 변경 사항을 적용합니다. 이 작업을 자동화 (주어진 뻗어 사용자 정의하는 방법의 스크립트와 방향의 스크린 샷에 대한 추가 정보를 참조) 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 2.5 %, 5 %, 7.5 %의 L 오의 스트레치 길이와 / 15 초 20, 40, 또는 60 %의 L 오의 스트레치 속도로 4 초 램프 홀드 뻗어을 적용합니다. 참고 : 필요한 전압 – mm 환산 계수에 대한 구체적인 힘과 길이 컨트롤러에 대한 사용자 설명서를 참조하십시오. 실험의 끝에서, 최대 아이소 메트릭 파상풍의 수축 (500 밀리 기차, 120 Hz에서 기차 주파수, 0.5 밀리 초 펄스 폭, supramaximal 전압)를 사용하여 24 ° C에서 근육의 건강을 결정합니다. 이전에보고 된 값과 피크 수축력 비교 (~ 24 N / cm 2 9,20).