양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지
Summary
BDNF, 신경 영양 인자의 축삭 수송은 여러 신경 인구의 생존과 기능을 위해 중요하다. 일부 퇴행성 질환은 축삭 구조와 기능의 장애로 표시됩니다. 우리는 차 신경 세포를 사용하여 미세 유체 챔버에서 QD-BDNF의 라이브 인신 매매를 검사하는 데 사용되는 기술을 보여 주었다.
Abstract
BDNF는 신경 세포의 생존, 분화 및 기능의 몇 가지 측면에서 중요한 역할을한다. 축색 돌기의 구조 및 기능 적자는 점점 알츠하이머 병 (AD)와 헌팅턴 병 (HD)을 포함한 신경 퇴행성 질환의 초기 기능으로 볼 수 있습니다. 아직까지 불분명 축삭 손상이 유발되는 메커니즘 (들)입니다. 우리는 생물학적 활성을 생산하는 신규 한 방법의 개발을보고, BDNF의 축삭 수송을 추적하는 데 사용될 수 BDNF (mBtBDNF)는 monobiotinylated. 양자점 표지 BDNF (QD-BDNF)가 mBtBDNF에 양자점 655 공역에 의해 제작되었다. 미세 유동 장치는 신경 세포체에서 축삭을 분리하는데 사용되었다. 축삭 구획 QD-BDNF의 추가 축삭에서 BDNF 수송의 라이브 영상을 허용했다. 우리는 QD-BDNF는 약 1.06 μm의 / sec의 이동 속도에서 거의 일시 정지와 역행 본질적으로 독점적으로 이동 있음을 보여 주었다. 이 시스템은 저를 조사하는 데 사용할 수 있습니다AD 또는 HD에서 중단 축삭의 기능뿐만 아니라 다른 퇴행성 질환의 chanisms.
Introduction
신경 세포는 고도의 그 긴 종종 고도로 정교한 프로세스 확립 및 신경 회로의 구조와 기능을 유지하기위한 기본이되는 셀을 편광된다. 축삭과 시냅스에서화물을 운반하는 중요한 역할을한다. 소마 세포에서 합성 된 단백질은 신경 세포 소기관 및 기능을 지원하는 시냅스 전 말단에 도달하는 축삭을 통해 전송 될 필요가있다. 대응하여, 신호는 말단 축색 돌기가 형질 도입 될 필요가 수신 및 소마로 반송. 이러한 프로세스는 신경 세포의 생존, 분화 및 유지 관리에 필수적이다. 일부 신경 축삭에서 그 전송을 통해 거리보다 1000 배 세포체의 직경을 수행해야에서 가능성 용이 심지어 작은 결손이 현저하고 신경 회로 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것을 구상한다.
뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 성장 인자의 뉴로 트로 가족의 일원은, 엄마의 존재해마, 대뇌 피질과 기저 전뇌를 포함하여 뉴욕의 뇌 영역. BDNF는인지 회로에 참여하는 신경 세포의 생존, 분화 및 기능을 지원하여인지와 기억 형성에 중요한 역할을한다. BDNF는 그것이 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 / 세포 외 신호 – 조절 된 단백질 키나제 (MAPK / ERK), 포스파티딜 이노시톨 3 – 키나제 포함 TrkB-매개 신호 전달 경로를 활성화 축삭 말단, 수용체, 티로신 키나아제 TrkB에 바인딩 (PI3K) 및 포스 포 리파제 C-감마 (PLCγ). 이러한 신호 전달 경로에 참여하는 단백질은 다음 역행 신경 소마로 이송하는 엔도 좀 1-6 신호 BDNF / TrkB를 형성하는 세포 내 이입 기공 구조에 포장됩니다.
마이크로 유체 문화 실 정상 조건에서뿐만 아니라 부상과 질병 7,8의 설정에서 축삭 생물학 연구를위한 매우 유용한 플랫폼이다. 분리 축삭으로세포 기관에서, 장치는 축삭 8-10에 구체적으로 교통을 연구하는 일을 허용했다. 본 연구에 사용 된 450 μm의 마이크로 그루브 장벽 PDMS 기반의 미세 유체 플랫폼은 상용 (재료 표 참조)을 구입 하였다. BDNF 전송을 조사하기 위해, 우리는 monobiotinylated BDNF (mBtBDNF)를 생산하는 새로운 기술을 개발했다. 우리는 (또한 AviTag라고도 함) 비오틴 수용체 펩타이드, AP를 이용했다. 그것은 특히 대장균 효소 리가 비오틴, 피라 의해 바이오틴에 결찰 될 수 리신 잔기를 포함하는 15 개의 아미노산 서열이다. 우리는 PCR (도 1a)에 의해 마우스 cDNA를 미리 proBDNF의 C-말단에 융합 AviTag. 구조체는 포유류 발현 벡터, 한 pcDNA3.1-myc의 자기 벡터에 클로닝 하였다. 또한 한 pcDNA3.1-myc의 자기 벡터에 피라 세균의 DNA를 클로닝. 두 플라스미드 모두 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293FT 세포로 공동 – 형질 감염시켰다. 피라는 비오의 결찰 촉매특히 라이신이 일에서 BDNF의 C-말단에 AviTag 내에 상주에서 : 1의 비율로 BDNF의 단량체를 monobiotinylated 생성한다. 비오틴은 ~ 18 kDa의 분자량의 BDNF와 성숙 회수 및 Ni-수지 (도 1C)를 사용하여 미디어에서 정제 하였다. (그림 1D)를 발현 수준에 의해 수정되지 않은 BDNF 감지 할 수없는 심판으로 BDNF의 바이오 티 닐화는 완전했다. 스트렙 타비 딘 결합 된 양자점, QD 655는 QD-BDNF를 만들기 위해 mBtBDNF 라벨을 사용 하였다. mBtBDNF이 인산화 TrkB (그림 1E)를 활성화하고 재조합 인간 BDNF (rhBDNF)의 정도에 신경 돌기의 파생물 (그림 1 층)을 자극 할 수 있다는 AviTag의 존재는 BDNF의 활동을 방해하지 않았다. QD-BDNF는 QD-BDNF는 생리 활성 (그림 1G) 인 것을 나타내는, 해마 축삭에서 TrkB와 colocalized 것으로 나타 면역 염색. BDNF 전송을 연구하기 위해, QD-BDNF는 원위부 축삭 구획에 추가쥐 E18 해마 신경 세포 (그림 2A)를 포함하는 마이크로 유체 문화. 축삭 내 QD-BDNF 역행 전송은 적색 형광 태그 (지원 영상 S1, S2)의 실시간 라이브 영상에 의해 체포됐다. 생성 kymograph를 분석함으로써, QD-BDNF는 약 1.06 μM / 초 (도 3a)의 이동 속도로 역행 수송 될 것으로 관찰되었다. GFP 또는 mCherry – 태그 BDNF는 BDNF의 축삭 이동을 추적하는 데 사용되었다. 주요 단점은 단일 분자 연구에 충분히 밝은하지 수 있다는 점을들 수있다. 또한, 선행 성 모두와 역행 BDNF 움직임의 존재 어려운 역행 수송 BDNF는 뉴로 트로 / 수용체 복합체에 참여할지 여부를 평가하기 위해 만든다.
이 비디오에서는, 우리는 차 신경 세포를 사용하여 미세 유체 챔버에서 QD-BDNF의 라이브 인신 매매를 검사하는 데 사용되는 기술을 보여줍니다. ultrabrightness 및 양자점 살려 우수한 광 안정성에스 것이 가능 BDNF 수송의 장기 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 AD, HD, 및 다른 신경 퇴행성 질환에서 축삭의 기능 연구를 향상시키기 위해 이용 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서 우리는 생물학적 활성을 생산하는 신규 한 방법의 개발을보고, BDNF의 축삭 수송을 추적하는 데 사용될 수 BDNF (mBtBDNF)를 monobiotinylated. 양자점 스트렙에 단백질 컨쥬 게이트, 및 마이크로 유체 챔버를 사용함으로써, 상기 방법은 하나는 실시간 및 시공간 해상도와 단일 분자 감도 차와 뉴런의 BDNF의 축삭 전송을 검출 할 수있다. 여기에서 사용 된 도구는 건강과 질병에서 신경 세포에서 B…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원을 왕위 (바오로) 후진타오, 레이첼 Sinit에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NIH 보조금 (PN2의 EY016525)에 의해 및 다운 증후군 연구 및 치료 재단과 래리 L. Hillblom 재단에서 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 |
| BamHI | Fermentas | FD0054 |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV |
| d-biotin | Sigma | B4639 |
| TurboFect | Fermentas | R0531 |
| PMSF | Sigma | P7626 |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 |
| protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 |
| silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 |
| human recombinant BDNF | Genentech | |
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 |
| 24×40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 |
| poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 |
| HBSS | Gibco | 14185-052 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 |
| B27 | Gibco | 17504-044 |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 |
| trichloroacetic acid | Sigma | T6399 |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | |
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
Referencias
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington’s disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
