Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren
Summary
This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.
Abstract
Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.
Introduction
Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9.
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Luciferase basierenden Ansatz bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen bestehenden Methoden einschließlich der Leichtigkeit, Schnelligkeit, Minimalausstattung notwendig und relativ niedrigen Kosten. Ein wichtiger Beitrag dazu ist die Vermeidung eines Verdünnungsschritt. Dennoch sind Verdünnungsbasierte Derivate dieses Protokoll sicherlich möglich und wurden vor kurzem zur Luciferase-exprimierenden Ebola-Titer in einem Hochdurchsatz-Antivirus-Bildschirm von 11 zu bewerten. Während naturgemäß zeitaufwändig und teurer, können solche Anpassungen größeren Dynamikbereich für die virale Quantifizierung bieten, wenn nötig. Zusätzlich dazu, dass sich besonders gut zur Auswertung Virustiter im Rahmen der Hochdurchsatz geeignet ist, erzeugt unser Ein-Schritt-Luciferase-basierte virale Quantifizierungsverfahren genaue Schätzungen von infektiösen Virionen bei der Replikation von Viren. Weiterhin Auslesungen der Lumineszenz mit Zytotoxizität von demselben Experiment ergeben einvollständiges Bild der Wirkung der Versuchsbedingungen auf Zielzellen, die besonders nützlich im Zusammenhang mit der onkolytischen Viren und Drogen-Bildschirme ist.
Das hier dargestellte Beispiel wird eine Replikation von negativen Einzelstrang RNA-Virus; Jedoch kann dieses Protokoll auf eine Anzahl von replizierenden und nicht-replizierende Viren mit einigen geringfügigen Anpassungen Protokoll angepasst werden. Dazu gehören DNA-Viren, wie Vaccinia, HSV und AAV (siehe Abbildung 5). Proben mit intrazelluläre Viren, wie Vaccinia-Virus infiziert sind beispielsweise, eine Virentrennschritt vor der Quantifizierung (zB mindestens einem Gefrier-Auftau-Zyklus). Bei der Anwendung dieser Technik auf andere Viren, ist es notwendig, die Reaktionszeit von der Übertragung des viralen Überstand oder Lysat, um das Lesen der Platten durch das Luminometer zu optimieren. Dieser Parameter wird in erster Linie auf der Replikationszyklus des Virus in der permissiven Zelllinie und der Stärke der p hängenromoter Fahr Luciferase-Expression. Dies geschieht am besten mit Hilfe der Standardkurve voll in die Optimierung Schritt getan. Um dies zu tun, muß man die entsprechende permissive Zellinie mit verschiedenen Wiederholungen des hergestellten Standardkurve zu infizieren und zu lesen jede Wiederholung bei einer verschiedenen Zeitpunkten nach der Übertragung. Idealerweise wird eine Inkubationszeit Punkt gewählt, die zu einer linearen Beziehung zwischen log (RLE) und LOG (Titer) führt überspannt den erwarteten Proben Titerbereich. Für VSVΔ51-Fluc ist dies typischerweise von 10 4 pfu / ml bis 10 7 pfu / ml für 5 Stunden Inkubationszeit. Wenn niedrigeren oder höheren Titer von Proben erwartet, kann man einfach mit höheren oder niedrigeren die Inkubationszeit. Alternativ können Proben verdünnt werden, um in dem Bereich viel, wie es typischerweise für ELISA getan fallen.
Wie oben erwähnt, ist dieses Verfahren gut geeignet, um hohen Durchsatz Drogen-Bildschirme mit Wirkstoffbibliotheken meisten Schritte können automatisiert durchzuführen. Zellen plattiert efficiently unter Verwendung eines automatisierten Mikroplatten-Dispenser kann die Medikamentenbibliothek unter Verwendung eines 96-Kanal-Handler Flüssigkeit zugegeben werden kann, kann unter Verwendung eines Mikroplatten-Virus Spender zugesetzt, und die Platten gelesen unter Verwendung eines automatisierten Luminometer. Theoretisch kann dies auch für 384er oder kleinere Formate angepasst werden; jedoch die Einschränkung zu diesem Zweck ist die Anzahl der Zellen, die plattiert werden können, da weniger Zellen führt zu einem engeren Bereich in der Linearität der LOG (RLU) bis (Titer) Beziehung Protokoll. Schließlich können Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Resazurin oder andere Stoffwechsel Farbstoffe leicht in den Workflow integriert werden, so dass für die Diskriminierung von zytotoxischen Verbindungen in der antiviralen Bildschirmen oder zur Identifizierung von Verbindungen, die an synergistische Tötung in Kombination mit Viren 12 führen. Dennoch Beschränkungen dieses Verfahrens umfassen das Erfordernis eines Luciferase-Transgen exprimierenden Virus, was nicht immer möglich ist, und die Verfügbarkeit eines ausreichend permissive Zelllinie. , Wahrscheinlich möglich, anzupassen, ist es jedochVerfahren zur Verwendung mit anderen Reportergene (zB GFP) bereitgestellt Reporter Quantifizierungsverfahren eine geeignete Linearität und das Signal-Rausch-Verhältnis. Insgesamt können die beschriebenen Verfahren mit hohem Durchsatz angepasst werden, um viele verschiedene Viren entsprechen und unterschiedliche Anwendungen zugeschnitten.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96 well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
Referencias
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