عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف
Summary
This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.
Abstract
Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.
Introduction
Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9.
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.
Protocol
Representative Results
Discussion
النهج القائم على وسيفيراز الموصوفة هنا يوفر عددا من المزايا أكثر من غيرها من الطرق القائمة بما في ذلك سهولة والسرعة، ومعدات الحد الأدنى من الحاجة، وبتكلفة منخفضة نسبيا. والمساهم الرئيسي في ذلك هو تجنب خطوة التخفيف التسلسلية. ومع ذلك، مسلسل المشتقات القائم على التخفيف من هذا البروتوكول هي بالتأكيد مجدية واستخدمت مؤخرا لتقييم، معربا عن وسيفيراز التتر إيبولا في الشاشة المضادة للفيروسات الإنتاجية العالية 11. في حين أن أكثر بطبيعتها تستغرق وقتا طويلا وأكثر تكلفة، ويمكن أن توفر هذه التعديلات أكبر النطاق الديناميكي لالكمي الفيروسي عند الضرورة. بالإضافة إلى كونها خاصة مناسبة تماما لتقييم التتر الفيروسية في سياق شاشات عالية الإنتاجية، طريقة القياس الكمي الفيروسي خطوة واحدة وسيفيراز استنادا يولد لدينا تقديرات دقيقة لvirions المعدية في حالة تكرار الفيروسات. وعلاوة على ذلك، قراءات من التألق مع بيانات السمية الخلوية من نفس التجربة تعطي أكثرصورة كاملة عن تأثير الظروف التجريبية على الخلايا المستهدفة، وهي مفيدة بشكل خاص في سياق الفيروسات حال الورم وشاشات المخدرات.
على سبيل المثال يتضح هنا يستخدم السلبي ضفيرة واحدة فيروس RNA تكرار. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول إلى عدد من تكرار وتكرار غير-الفيروسات مع بعض التعديلات الطفيفة البروتوكول. وهذا يشمل فيروسات الحمض النووي مثل الوقس، HSV، وAAV (انظر الشكل 5). عينات الخلايا المصابة بفيروسات مثل فيروس الوقس على سبيل المثال، تتطلب خطوة فيروس الإفراج قبل الكمي (مثل دورة تجميد ذوبان الجليد واحد على الأقل). عند تطبيق هذه التقنية لفيروسات أخرى، فمن الضروري لتحسين فترة حضانة من نقل طاف الفيروسية أو المحللة لقراءة لوحات من قبل luminometer. وسوف تعتمد هذه المعلمة بشكل رئيسي على دورة النسخ المتماثل للفيروس في خط خلية متساهل وقوة عromoter القيادة التعبير وسيفيراز. من الأفضل القيام بذلك عن طريق استخدام منحنى القياسية الكامل في الخطوة الأمثل. للقيام بذلك، يجب على المرء أن تصيب خط الخلية متساهل المناسب مع مكررات مختلفة من منحنى القياسية وأعدت قراءة كل تكرار في وقت مختلف نقاط بعد نقل. من الناحية المثالية، يتم اختيار نقطة وفترة حضانة الذي يؤدي إلى وجود علاقة خطية بين سجل (RLU) وسجل (عيار) التي تغطي مجموعة وعينة عيار المتوقع. لVSVΔ51-Fluc، وهذا هو عادة من 10 4 PFU / مل -10 7 PFU / مل لفترة حضانة 5 ساعة. إذا كان من المتوقع من عينات التتر أقل أو أعلى، يمكن للمرء ببساطة زيادة أو تقليل فترة حضانة التوالي. بالتناوب، يمكن تخفيفه عينات لتقع ضمن نطاق الكثير كما هو الحال عادة لELISA.
كما ذكر أعلاه، هي مناسبة هذه الطريقة بشكل جيد لأداء شاشات المخدرات الإنتاجية العالية باستخدام مكتبات المخدرات لأن معظم الخطوات التي يمكن الآلي. خلايا يمكن مطلي الإلكترونيةfficiently باستخدام موزع صفيحة ميكروسكوبية الآلي، يمكن إضافة مكتبة المخدرات باستخدام معالج السائل 96 قناة، ويمكن أن يضاف فيروس باستخدام موزع صفيحة ميكروسكوبية وقراءة لوحات باستخدام luminometer الآلي. من الناحية النظرية، وهذا يمكن أيضا أن تتكيف مع 384 بئر أو صيغ أصغر؛ ومع ذلك، فإن القيد لتحقيق هذه الغاية هو عدد الخلايا التي يمكن مطلي، نظرا عدد أقل من خلايا يؤدي إلى مجموعة وأضيق في الخطي من سجل (RLU) لتسجيل الدخول (عيار) العلاقة. أخيرا، وتقييم بقاء الخلية باستخدام ريسازورين أو الأصباغ الأيضية الأخرى يمكن أن تدمج بسهولة في سير العمل، مما يسمح للتمييز من المركبات السامة للخلايا في شاشات المضادة للفيروسات أو تحديد المركبات التي تؤدي إلى قتل التآزر في تركيبة مع الفيروسات 12. ومع ذلك، فإن القيود المفروضة على هذه الطريقة فإن شرط وسيفيراز فيروس التحوير التعبير، وهي ليست دائما ممكنة، وتوافر خط خلية متساهل بما فيه الكفاية. ومع ذلك، فمن المرجح ممكن للتكيفطريقة للاستخدام مع مراسل الجينات الأخرى (مثل GFP) توفير طريقة مراسل الكمي لديه الخطي مناسبة وإشارة إلى نسبة الضوضاء. وعموما، فإن طريقة الإنتاجية العالية وصفها يمكن تعديلها لتناسب العديد من الفيروسات المختلفة ومصممة لتطبيقات متنوعة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96 well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
Referencias
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J. Uses of flow cytometry in virology. Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
