Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, un colonizador común de la comunidad polimicrobiana de la nasofaringe, es capaz de competir con otros neumococos y especies estrechamente relacionadas con la producción de péptidos antimicrobianos producidos por bacterias (bacteriocinas). Cada cepa de neumococo totalmente secuenciado-examinado hasta la fecha contiene una versión de la l ike locus p eptide b acteriocin-, BLP. La producción de bacteriocina por el neumococo ha demostrado ser importante en el resultado de tanto in vitro como in vivo en la competición 1-4. Dinámica competitiva están influenciados por la expresión de diversas bacteriocinas junto con proteínas de la inmunidad afines en respuesta a una feromona específica de péptido. Inducción del locus BLP está controlado por un sistema de detección de quórum en la que una feromona péptido, BLPC, se une a la quinasa sensor, BlpH, e inicia una cascada de señalización que resulta en lala transcripción del locus 5,6 BLP. Hay cuatro variaciones alélicas de BLPC que se unen cada uno a su BlpH afines 6. Para la célula para sobrevivir a los efectos de su propia bacteriocina, los genes que codifican proteínas de la inmunidad afines se transcriben en el mismo operón como cada uno de los genes de bacteriocina. Killing se produce si una cepa competidor no es capaz de regular positivamente el locus BLP en respuesta a la feromona exógeno o, si la cepa carece del gen de inmunidad específica necesaria para la protección. El complejo transportador, BlpAB se requiere para la secreción y el procesamiento de la feromona de péptidos y los péptidos de bacteriocina 2,4. Recientemente, se ha demostrado que una proporción significativa de cepas neumocócicas son "tramposos" que significa que tienen una mutación en el gen conservado BLPA que las hace incapaces de secretar feromonas y bacteriocinas 1,2. Estas cepas son capaces de responder a BLPC exógeno 2 secretada por relinchocepas aburridas que permitan la producción de proteínas de la inmunidad.
Aunque, preparaciones crudas de bacteriocinas a partir de sobrenadantes se pueden preparar a partir de cepas de productores usando métodos pasos bioquímicos para lograr la pureza, este enfoque no es útil para el cribado de grandes colecciones de cepas y si el nivel de expresión de bacteriocina es baja en caldos de cultivo crecido 2,7- 9. La superposición de ensayo se utiliza como una forma rápida para investigar la dinámica competitiva entre las cepas que puedan existir en vitro. Para ello, una cepa neumocócica es pre-inocularon en una placa de agar y se dejaron crecer hasta alcanzar concentraciones bacterianas locales suficientes para la inducción del locus BLP. Una segunda cepa se inocula luego en una solución de agar blando fundido que se aplica entonces sobre la cepa de pre inoculado para la prueba de sensibilidad. Para evaluar la actividad del locus BLP (independiente de la actividad inhibitoria), las cepas pueden ser superpuestos con una serie de juree reportero cepas BLPC descritos anteriormente. Se construyeron estas cepas para contener uno de los tres alelos blpH diferentes que responden a las tres feromonas BLPC más comunes secretadas por el neumococo. Las cepas indicadoras tienen un gen lacZ integrado que está bajo el control de un promotor dependiente de BlpH y llevar a una deleción en el gen BLPC que impide la auto-estimulación 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta superposición de ensayo es una manera rápida de determinar la gama de actividades para los productores de bacteriocinas y para demostrar las interacciones competitivas que pueden ocurrir entre las cepas de neumococo. El ensayo de superposición se puede adaptar a utilizar para la detección de múltiples cepas para la producción de bacteriocina en una sola placa. Hemos analizado con éxito grandes colecciones de cepas con este ensayo mediante el uso de un replicador de 48 pines para inocular placas de SBA de la …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
Referencias
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