JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología

فيفو السابقين الثقافة من ذبابة الفاكهة العذراء خصية واحدة ذكر الخراجات جرثومة خط: تشريح، التصوير، والمعالجة الدوائية

Published: September 11, 2014
doi:
10.3791/51868
, , ,
1Fachbereich Biologie, Entwicklungsbiologie,Philipps-Universität Marburg, 2Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung,Philipps-Universität Marburg

Summary

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Abstract

خلال تكوين الحيوانات المنوية في الثدييات وذبابة الفاكهة في البطن، والخلايا الجرثومية الذكور في تطوير سلسلة من العمليات التنموية الأساسية. ويشمل هذا التمايز من السكان الخلايا الجذعية، والتضخيم الإنقسامية، والانقسام المنصف. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الجرثومية بعد الانتصافي الخضوع لعملية إعادة تشكيل جذرية المورفولوجية، فضلا عن إعادة تشكيل جينية العالمية من خط الجرثومية الكروماتين على مفتاح هيستون، لبروتامين.

دراسة دور البروتين في الحيوانات المنوية بعد الانتصافي باستخدام الطفرات الوراثية أو أدوات أخرى غالبا ما تعيقها الجنينية الأساسية، قبل الانتصافي، أو وظائف الانتصافي من البروتين قيد التحقيق. يمكن حجب النمط الظاهري بعد الانتصافي من المسخ مثل هذا البروتين من خلال كتلة التنموي سابق، أو تفسير النمط الظاهري يمكن أن يكون معقدا. الكائن نموذج ذبابة الفاكهة السوداء البطن يقدم تجاوز لهذه المشكلة: الخصيتين سليمة وحتى الخراجات من الخلايا الجرثومية تشريح من الشرانق في وقت مبكر قادرة على تطوير فيفو السابقين في مستنبت. الاستفادة من مثل هذه الثقافات يسمح التصوير المجهري المعيشة الخلايا الجرثومية في الخصية والخراجات خط الجرثومية. الأهم من ذلك، أصبحت الخصيتين المزروعة والخلايا الجرثومية أيضا الوصول إلى مثبطات الدوائية، مما يسمح التلاعب من خلال وظائف الأنزيمية الحيوانات المنوية، بما في ذلك مراحل ما بعد الانتصافي.

يصف بروتوكول المعروضة كيفية تشريح وزراعة الخصيتين العذراء والخراجات خط الجرثومية. يتم توفير المعلومات حول تطور الخصيتين العذراء والشروط الثقافة جنبا إلى جنب مع بيانات التصوير المجهر من الخصيتين الحية والخراجات خط الجرثومية في الثقافة. نحن أيضا وصف مقايسة الدوائية لدراسة الحيوانات المنوية بعد الانتصافي، ومن أمثلته مقايسة استهداف التبديل هيستون، لبروتامين باستخدام مثبطات حمض أسيتيل هيستون اناكارديتش. من حيث المبدأ، يمكن تكييف هذه الطريقة لزراعة معالجة العديد سأسئلة البحث ذر في تكوين الحيوانات المنوية قبل وبعد الانتصافي.

Introduction

تطوير الخلايا الجرثومية الذكور لكثير من الأنواع هي عملية متتابعة. ويتميز هذا من خلال سلسلة من الأحداث الحاسمة التي يبلغ ذروته في تشكيل الحيوانات المنوية شكليا وepigenetically درجة عالية من التخصص. في ذبابة الفاكهة السوداء، خط الخلايا الجذعية الجرثومية في طرف الفجوة الخصية غير متماثلة لتؤدي إلى خلية جذعية جديدة وspermatogonium، أي خلية ابنة ملتزمة التمايز (انظر الشكل 1 لمحة عامة) 1،2 . وspermatogonium يخضع أربع جولات من الانقسامات الإنقسامية و، مع بداية الانقسام الاختزالي، تسمى مرحلة النمو الهائل والنشاط النسخي مرحلة خلية نطفية. الخلايا الناشئة من spermatogonium واحد البقاء على اتصال مع بعضها البعض وتطوير كحزمة واحدة متزامنة ملفوفة من قبل اثنين من الخلايا الجسدية لهيكل يشار إلى الكيس. بعد الانتهاء من الانقسام المنصف، مورفولوجيا الخلايا الجرثومية الذكور تماماتنظيم (كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1). في البداية، spermatids مستديرة استطال لتشكيل هيكل رئيس الهيدروديناميكية، والسوط يتطور. في نهاية المطاف، يتم فصل الخلايا المنوية عن بعضها البعض من قبل، آلية معقدة تسمى الخلايا المرتبطة الفردية 3-5.

في كثير من الأنواع، بما في ذلك ذبابة الفاكهة السوداء وأنواع الثدييات، والتغيرات المورفولوجية للخلايا الجرثومية تكون مصحوبة إعادة ترتيب جينية لافت للفرداني الذكور خط الجرثومية الكروماتين، دعا التبديل هيستون، لبروتامين (HP التبديل) 6-9. ربما تقريبا يتم تجريد جميع هيستون الكنسي والعديد من الجزيئات هيستون-البديل من الحمض النووي ويتم استبدال البروتينات الأساسية الصغيرة، وprotamines، مما أدى إلى بروتامين النواة هيكل مدمج للغاية محددة إلى لونين من الحيوانات المنوية الناضجة. الخصائص العامة للتبديل HP هي رانه استبدال الهستونات الكنسي أول من المتغيرات هيستون، ثم البروتينات الانتقالية، وأخيرا protamines. كل هذا يرافقه العديد من التغييرات على علامات جينية، مثل زيادة في مستويات أستلة هيستون H4 قبيل إزالة هيستون 7،10 – 12.

معظم، إن لم يكن كلها، من العمليات المذكورة أعلاه ضرورية لتطوير ناضجة، الحيوانات المنوية خصبة بشكل كامل. وهذا صحيح ليس فقط في ذبابة الفاكهة ولكن أيضا في البشر، كما أسهم الحيوانات المنوية الثدييات قدرا كبيرا من التشابه مع 1،8،9 نظام اللافقاريات. دراسة تطور الخلايا الجرثومية الذكور مما يسهل إلى حد كبير في نظام نموذجي ذبابة الفاكهة. الذباب يمكن الوصول إليها غاية وراثيا. جيل من المسوخ وكذلك إنشاء سلالات ذبابة معربا عن الجينات الانصهار أو يبني تدخل RNA يأخذ القليل من الجهد. ومع ذلك، في دراسة الحيوانات المنوية بعد الانتصافي، واستخدام المسوخ وأدوات بسيطة د الوراثية قد تصل الى حد. في ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية، النسخ توقف تماما تقريبا مع دخول الانقسامات الانتصافي. وهكذا، ويستند تكوين الحيوانات المنوية بعد الانتصافي أساسا على قمع من mRNAs translationally وتخزينها توليفها في الطور الأول الانتصافي الموسعة 13-16. لذا، أدوات مثل التدخل RNA أو استخدام طفرات غير مشروطة ليست مناسبة لدراسة تحديدا الأدوار بعد الانتصافي من المنتجات الجينات التي تلبى أيضا المهام الأساسية في التنمية الخلية الجرثومية قبل الانتصافي أو الانتصافي.

ميزة واحدة من ذبابة الفاكهة التي يمكن استغلالها في مثل هذه الحالات هي قدرة الخصيتين سليمة تشريح وحتى الخراجات من الخلايا الجرثومية لتطوير فيفو السابقين في مستنبت 4،12،17 – 20. تشريح وزراعة الخصيتين أو الخراجات خط الجرثومية يسمح الملاحظة المجهرية ليس فقط من تطوير خلايا جرثومية في الخلايا الحية، ولكنيسوتو استخدام المقايسات الدوائية مع، على سبيل المثال، مثبطات انزيم المجمعات مثل acetyltransferases هيستون (القبعات)، deacetylases هيستون (HDACs)، topoisomerases، أو proteasome. وبالتالي، فمن الممكن للتلاعب وظائف الأنزيمية خلال تكوين الحيوانات المنوية بعد الانتصافي ورصد النتائج التنموية بغض النظر عن وظائف الجنينية، قبل الانتصافي، أو الانتصافي 4،12.

في المقايسات الدوائية، ونحن سبق تحليلها توطين تعتمد على أستلة من بروتين bromodomain خلال الطور الأول الانتصافي فضلا عن أهمية مستويات هيستون أستلة لHP التبديل جينية في الحيوانات المنوية بعد الانتصافي باستخدام مثبطات معينة تستهدف القبعات وHDACs 12،21. وجاء استهداف التبديل HP في هذه المقايسات الممكن باستخدام سلالة ذبابة تعبر عن الجينات الانصهار histone2AvD-RFP وprotamineB-EGFP 12،22 في أنماط الذاتية، وملاحظة أنوspermatids الأولى في الخصيتين العذراء تمر من خلال التبديل HP بين 24 و 48 ساعة APF 12.

بروتوكول قدم يصف تشريح الخصيتين والخراجات من ذبابة الفاكهة الشرانق، والظروف والثقافة، ومقايسة الدوائية مع الخصيتين العذراء سليمة. لهذا الغرض، يتم تشريح الخصيتين العذراء في حوالي 24 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) (أنظر الشكلين 1 و 2). في هذا الوقت، لم تقدم الخصيتين وصلات إلى الأنسجة الأخرى، وتحيط به فقط غمد الخارجي رقيقة، والذي يسمح أفضل الاختراق من قبل مركبات مثبطات 23،24. الخصيتين هي الأجهزة bean- أو على شكل الكمثرى التي يمكن اتخاذها بسهولة في الثقافة. يتم تشريح هذه الخصيتين، مثقف، وتعامل مع مثبطات معينة. بعد ذلك، يتم رصد آثار مثبطات المناعي باستخدام تحليل والفحص المجهري مضان من البروتين الانصهار التعبير، والمقارنة بين morphol النوويةogy من الخلايا الجرثومية المعالجة إلى أن الخلايا الجرثومية غير المعالجة. الشروط الواردة في هذا البروتوكول أيضا يسمح التصوير المباشر لتطوير الخصيتين والخراجات خط الجرثومية في الثقافة.

Protocol

بيان الأخلاق: الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول تنطوي يعمل حصرا مع ذبابة الفاكهة السوداء البطن ولا تخضع لقوانين الرفق بالحيوان في ألمانيا. 1. إعداد وسائل الإعلام، أدوات، والذباب إعداد تعديل متاحة تجاريا المجفف المتوسطة النمو M3 دون بيكربونات البوتاسيوم 17. تنبيه: مهيج للعين والجلد. تكملة المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني، 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. استخدام مصل بقري جنيني اختبار الحشرات ثقافة المعطل الحرارة وحصول على أفضل النتائج. تصفية المتوسطة كاملة (المشار إليها فيما بعد باسم المتوسطة) خلال 0.2 ميكرون وحدة تصفية زجاجة أعلى وتخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، مرشح (فلتر 0.2 ميكرومتر حقنة غيض) المتوسط ​​مرة أخرى لإزالة الرواسب. إعداد الحلول الأسهم المانع للفحوصات الدوائية. Dissolلقد المواد الكيميائية في المذيب وتخزين المناسب في مأخوذة. على سبيل المثال، إعداد محلول المخزون من 28.69 ملي حمض اناكارديتش (تنبيه: مهيج للعين والجلد) في ديمثيلكبريتيد. إعداد أدوات لتعطيل الخصيتين العذراء تشريح تشريح والخراجات واحدة. استخدام اثنين من الإبر الحادة والشديدة، بدلا من زوج من ملقط. القوة الشعرية التي تطور بين أحضان زوج من ملقط تشريح يجعل من الخراجات واحدة في المتوسط ​​كميات صغيرة من الصعب جدا. على سبيل المثال، استخدام غيض من الفولاذ المقاوم للصدأ دبوس الحشرات إدخالها على حامل حلقة التلقيح. من أجل الحصول على الشرانق العمر مناسب، كاليفورنيا. البذور 10 قارورة ثقافة كبيرة (مع أنابيب قطرها 4 سم) مع وجود عدد كاف من الذباب الكبار (حوالي 40-60 الذباب). لتحليل التبديل HP، استخدم الذباب معربا عن H2AvD-RFP وProtamineB-EGFP في نمطها الذاتية 12،16،22. احتضان قارورة تحت الظروف القياسية عند 25؛ درجة مئوية لمدة حوالي 4-5 أيام حتى الطور الثالث اليرقات الزحف صعودا وبدء التشرنق على جدران قارورة 25. 2. تمييز أو جمع الشرانق الأبيض قبل الحصول على شرانق عمره 24 ساعة لتشريح لاختبار تأثير بعض المواد الكيميائية على التبديل HP، تشريح الخصيتين العذراء في حوالي 24 ساعة APF 12. للحصول على الشرانق نظموا، واتخاذ مستعدة قارورة ثقافة ذبابة مع pupating اليرقات (انظر القسم 1.4) وتحديد أكبر عدد ممكن من البيض قبل الشرانق ممكن. قبل الشرانق خلال الخطوة الأولى في التشرنق كما تظهر بلا حراك، غير التغذية، اليرقات تقصير وليس مع الفتحات التنفسية مقلوبة وpuparium بيضاء اللون. يصبح puparium تان البني في غضون 30 إلى 60 دقيقة، مما يدل على المرحلة التالية من التنمية العذراء 26. بمناسبة مواقف ما قبل الشرانق مع علامة دائمة على السطح الخارجي للقارورة. احتضان قارورة عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 24 ساعة. بدلا من ذلك،اختيار قبل الشرانق من جانب قارورة مع فرشاة صغيرة مبللة مع العازلة PBS. ثم نقل ما قبل الشرانق الى جانب 50 مل أنبوب رد فعل الطازجة واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 24 ساعة. 3. تشريح العذراء الخصية في حوالي 24 ساعة بعد تشكيل Puparium توزيع عدة قطرات (حوالي 80 ميكرولتر لكل منهما) من المتوسط ​​على 10 سم ثقافة الخلية البلاستيك أو طبق بتري. باستخدام زوج من ملقط اسعة أو فرشاة مبللة المتوسطة، واختيار الشرانق في 24 ساعة APF مرحلة من قنينات المحتضنة (انظر القسم 2). نقل خادرة واحدة إلى كل قطرة من المتوسط ​​على الطبق. للتشريح، واستخدام المجهر ستيريو مجهزة إضاءة الألياف الضوئية. لا حرارة الخصيتين فوق RT أثناء تشريح لأن ذلك قد منع التنمية السليمة في الثقافة. تشريح الشرانق مع اثنين من أزواج من رقم 5 ملقط. مع زوج واحد، والاستيلاء على خادرة في معظم الخلفي لهاجزء (من الفتحات التنفسية الخلفي) والاحتفاظ بها في الموقف. الاستيلاء على الفتحات التنفسية الأمامية مع زوج آخر من ملقط وفتح الغطاء الخيشومي العذراء في نهايته الأمامية. تقشر حالة العذراء حتى يتعرض ما لا يقل عن جزء من القفص الصدري. الاستمرار في عقد خادرة في الموقف من نهايتها الأكثر الخلفية. للافراج عن الضغط الداخلي للخادرة، إدراج كل من أحضان زوج من ملقط في منطقة الرأس من خادرة. مزق خادرة مفتوحة عن طريق فتح ملقط ملقط والتحرك في الاتجاه الأمامي. تأكد من أن فتح ولدت مع هذه الحركة هو كبير ممكن في المحاولة الأولى. تجنب إتلاف خادرة في نهاية الخلفي لها قبل أن يتم الإفراج عن الضغط لأن ذلك قد يؤدي إلى الخصيتين يتم دفعها مباشرة من خلال فتحة صغيرة، وغالبا ما يجري تعطلت. نلاحظ أنه بمجرد أن يتم فتح خادرة، الضغوط الداخلية التي تم إصدارها من خادرة يضغط من تكتلات من خلايا الجسم من الدهون والأنسجة من خلال لاافتتاح RGE في منطقة الرأس. تحقق ما إذا كان قد تم دفع الخصيتين العذراء للخروج من الشرنقة مع هذه المواد؛ هذا يحدث في بعض الحالات. لا ترتبط الخصيتين إلى أي نوع من الأنسجة الأخرى في 24 ساعة APF وبالتالي يمكن بسهولة طرد من خادرة 23. تجنب الضغط على خادرة مع ملقط لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الخصيتين إذا كانت لا تزال في خادرة. زيادة حجم الفتحة باستخدام زوج واحد من ملقط. ثم عقد خادرة في نهايته أكثر الخلفية. إغلاق الزوج الآخر من خط ملقط وبلطف من محتويات خادرة من الخلفية إلى الأمامية للافراج عن الخصيتين من خادرة. جمع الخصيتين عن طريق سحب منها الى 200 ميكرولتر ماصة خفض مسبقا. محاولة نقل سوى كمية صغيرة جدا من المتوسط ​​إلى خفض عدد خلايا الجسم الدهون المحولة مع الخصيتين. وضع الخصيتين في المتوسط ​​في طبق ثقافة جديدة. غسل الخصيتين عدة مرات مع المتوسط ​​حتى خلية الجسم قليل من الدهون فقطتبقى ق. للتصوير الحي، نقل الخصيتين إلى صحن ثقافة أسفل الزجاج مع المتوسطة واستخدام المجهر التصوير مقلوب. لفحوصات الدوائية، تابع الخطوة 5. 4. تشريح ذكر الخراجات خط جرثومة وتصوير لايف نقل واحد أو أكثر من الخصية العذراء إلى صحن ثقافة أسفل الزجاج. استخدام ستيريو المجهر مع إضاءة بالألياف البصرية واثنين من الإبر الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر القسم 1.3) لتشريح الذكور الخراجات خط الجرثومية. مع إبرة واحدة، في محاولة بعناية لأحدد خصية واحدة على نهاية الأمامية، أو الخلفية. لأنه عقد في الموقف. ادخال الإبرة الأخرى في الخصية وتعطيل غمد الخصية عن طريق تحريك الإبرة جانبية. سيتم اطلاق سراح العديد من الخراجات من الخصية بواسطة هذه الحركة. الاستمرار في عقد الخصية في موقف مع إبرة واحدة. خط برفق ما تبقى من الخراجات من الخصية مع الإبرة الأخرى. الخراجات تجميعها منفصلة إما عن طريق جنتلاي تتحرك إبرة جانبية من خلال مجموعة من الخراجات أو عن طريق نقل الأكياس إلى طبق جديد مع الثقافة المتوسطة باستخدام ماصة غيض 200 ميكرولتر. تحريك الطبق الثقافة إلى مجهر مقلوب التصوير لتصوير حي من الخراجات واحدة. تفريق الخراجات مرة أخرى مع إبرة إذا لزم الأمر. تحديد مرحلة الخراجات باستخدام مراحل التباين ومضان المجهري. التركيز على كيس من المرحلة المطلوبة. تأكيد التركيز ووضع الكيس في كثير من الأحيان خلال تجارب التصوير أطول، كما الخراجات لا تلتزم أسفل الطبق الثقافة، وبالتالي تميل إلى تعويم من التركيز. ملاحظة: طلاء الطبق مع بولي-L-يسين لتجميد يضر تطوير مبكرة الخراجات خط الجرثومية. بدلا من ذلك، الخراجات الفردية يمكن أن تكون معزولة. مع بعض الممارسة، فمن الممكن أن أخص بالذكر ورما معين عن طريق دفع برفق جدا مع الإبرة. هذا سيسمح نقل الخراجات واحدة لعبادة منفصلةأطباق لدى عودتهم مع ماصة باستير الزجاج مع طرف المطولة التي تناسبها في مجال الرؤية من المجهر. الخراجات معزولة ثم يمكن نقلها بسهولة في أطباق الثقافة حتى بعد حضانة طويلة الأجل. 5. الدوائية الفحص سليمة مع العذراء الخصية ملء كل بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية مع 500 ميكرولتر من المتوسطة لتجربة واحدة من 12 مكررات. نقل العذراء واحد الخصية إلى كل بئر، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر ماصة خفض مسبقا. تحقق من وجود protamines في الخصيتين المعزولة باستخدام المجهر مضان مقلوب. يجب أن يكون خاليا من الخصيتين إشارة ProtamineB-EGFP، مما يدل على أن التحول HP لم تتخذ مكان في أي من الخراجات. استبدال الخصيتين التي تظهر بالفعل الخراجات ProtamineB-EGFP إيجابية. إلى الآبار ال 12 الأولى، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي المخفف مجمع المانع (حمض اناكارديتش) للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب(150 ميكرومتر) في 1 مل من المتوسط ​​لكل بئر. استخدام الآبار المتبقية وضوابط غير المعالجة. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة مع نفس الكمية من المذيبات المستخدمة كما هو الحال مع مركبات مثبطات. ملاحظة: إذا تم استخدام العديد من المركبات والمذيبات المختلفة، قد يكون أكثر كفاءة في استخدام الوسيلة وحدها، والتحكم واختبار تأثير زيادة تركيزات المذيبات في تجارب منفصلة. احتضان لوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الظلام. التحقق مرة أخرى لوجود protamines في الخصيتين المحتضنة كما هو موضح أعلاه. يجب الخصيتين السيطرة تظهر الآن الخراجات واحد أو أكثر ProtamineB-EGFP إيجابية، مما يشير إلى التحول من خلال التبديل HP. باستخدام ماصة مع طرف 200 ميكرولتر، نقل الخصيتين إلى بولي-L-يسين المغلفة الشرائح، واتخاذ الاستعدادات الاسكواش وصمة عار مع الأجسام المضادة الفلورسنت المناسبة كما هو موضح في مكان آخر 12،27،28.

Representative Results

تتشكل الخصية في الذكور ذبابة الفاكهة بالفعل في الجنين واستمر في تجويف الجسم خلال مراحل اليرقات. الطور الثالث اليرقات تظهر صغيرة، الخصيتين مستديرة محاطة بطبقة من الخلايا الصبغية في المستقبل، وجزءا لا يتجزأ في أنسجة الجسم الدهنية (الشكل 2A). الخصيتين في الذكور البالغين هي الذباب، وأنابيب ملفوف طويلة، والتي تغطيها طبقة من الخلايا العضلية الناشئة من القرص الأعضاء التناسلية وطبقة الصباغ 24. ومن المثير للاهتمام، تحتوي على خلايا الخصيتين اليرقات خط الجرثومية فقط من المراحل السابقة للالانتصافي والانتصافي حتى المرحلة الابتدائية خلية نطفية، وهو ما يقابل الطور الانتصافي (انظر أيضا الشكل 1) 23. الأفواج الأولى من الخلايا الجرثومية الذكور تمر من خلال الانقسام الاختزالي خلال تشكيل puparium. في حوالي 24 ساعة APF، مراحل ما بعد الانتصافي مع سياط ممدود قد وضعت بالفعل، وكل نواة تحتوي هيستون H2AvD-RFP (الشكلان 1 و 2B). أي من spermatids خضعت رانه HP التبديل كما لا توجد إشارة ProtamineB-EGFP يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري مضان (الشكل 2C). في كثير من الأحيان، الخصيتين تشريح في هذه المرحلة تحتوي على هيكل السيارات الفلورسنت من حجم متغير تذكر لتكتل خلايا الجسم الدهون أو واحد إلى عدة قطرات من الزيت (الشكل 2C، رأس السهم). هذا الهيكل داخل الخصية هو أيضا مرئية مع مرحلة التباين المجهري. حتى الآن، لم نجد أي وصف لطبيعتها في الأدب. تشريح الخصيتين في 36 ساعة APF يبدو ممدود، وفي بعض الحالات تبدأ بالفعل إلى حليقة (الشكل 2D). وقد أرفقت أنها بالفعل لأنسجة الجهاز التناسلي نابتا من القرص تخيلي الأعضاء التناسلية 23،24. وعلاوة على ذلك، فإنها كثيرا ما تحتوي على spermatids الأولى خارج التبديل HP، كما يدل على ذلك إشارة ProtamineB-EGFP (الشكلان 1 و 2D، السهم). في 48 ساعة APF، الخصيتين لديك المزيد من ممدود ووضوح تبدأ في الشباكنهاية القريبة. عدة الخراجات خط الجرثومية مع نوى-بروتامين إيجابي تصبح مرئية (الشكل 2E، السهم). عندما يتم الاحتفاظ تشريح الخصيتين في 24 ساعة APF في الثقافة لمدة 24 ساعة، وأنهم لا استطال كما في ذبابة سليمة (قارن الشكل 2D و 2E مع الشكل 6A). هذا هو ربما يعود ذلك إلى عدم وجود إشارات الموضعية والنمو أرسلت عادة من الجهاز التناسلي تطوير الاتصال الخصية في الطرف الخلفي ل23،29. وعلاوة على ذلك، وطبقة العضلات من غمد الخصية لا تتطور بسبب myotubes الوليدة لا يمكن أن يهاجر من القرص إلى الأعضاء التناسلية الخصية 24. فقط الصباغ طبقة رقيقة لا لا يبدو غمد الخصية في هذه الحالة أن ينمو بما فيه الكفاية في الثقافة المغلف إلى العدد المتزايد من تطوير الخلايا الجرثومية داخل. ومع ذلك، تنمو الخلايا الجرثومية، والانقسام، وتفرق بشكل مستقل من غمد الخصية. وبالتالي، وبعد أكثر من 36 ساعةص في ​​الثقافة، فإن الخصيتين مبكرة في كثير من الأحيان تنفجر مفتوحة، وليس لوحظ مزيد من التطوير. ومع ذلك، في غضون فترة زمنية أقصر، فمن الممكن لتسجيل الوقت الفاصل بين فيفو السابقين صورا حية من الخصيتين بأكملها النامية في الثقافة، كما يتضح من أرقام 3A C -3 (انظر أيضا الفيديو التكميلي 1). وقد حضنت والخصية العذراء، تشريح في حوالي 45 ساعة APF، في المتوسط ​​لمدة 6 ساعة وتصوير كل 5 دقائق. ضمن هذا الإطار الزمني، عدة أكياس من spermatids الخروج من مرحلة التبديل HP وتظهر (3A أرقام "-3 C، السهام مفتوحة) مشرقة إشارة ProtamineB-EGFP. كما ذكر أعلاه، الخلايا الجرثومية في الخصية الذكور ذبابة الفاكهة تتطور كما هو حزم متزامنة من خلايا مترابطة، والخراجات اسمه 1. يبين الشكل 4A لمحة عامة عن تشريح الخراجات من الخصية العذراء في حوالي 24 ساعة APF. مراحل ما قبل الانتصافي، الانتصافي مراحل، الأولى مرحلة ما بعد الانتصافي، والخراجات أيضا في مرحلة مبكرة الزورق مع نوى ممدود قبل التحول HP يمكن العثور على (الشكلان 1 و 4B -4 E). الخراجات معزولة هشة جدا ويجب التعامل معها بعناية. الخلايا الجسدية التي تشكل اثنين المغلف الكيس ويمكن أن تتعطل بسهولة ميكانيكيا. خط الخلايا الجذعية الجرثومية لديها القدرة على البقاء والاستمرار بعد تقسيم الاجتثاث الجيني للخلايا الجسدية الكيس في الجسم الحي 30. وقد ورد أن في المختبر، الخلايا الجرثومية للمرحلة 16 خلية فصلها عن محيطهما الجسدية تطوير وتفرق 19. في الواقع، لاحظنا في نظام ثقافتنا أن الخلايا المنوية أواخر يفترض أكملت الانقسامات الانتصافي مع الخلايا الكيس تعطلت، وإن كان نادرا جدا. في معظم الأحيان، توقفت هذه الخراجات عطلت التنمية. بعد بروتوكول المقدمة، كيسات سليمة ربما في بعض الحالات DEVElop وخارج الحي في مستنبت لمدة أقصاها 72 ساعة. ومع ذلك، لاحظنا أن عدد معقول من الخراجات البقاء على قيد الحياة يصل إلى 48 ساعة من الحضانة. ضمن هذا الإطار الزمني، الخراجات المستزرعة هي قادرة على تطوير من المرحلة الابتدائية حتى بعد خلية نطفية الانقسامات الانتصافي وكذلك من مرحلة نواة مستديرة مع الكروماتين القائمة على هيستون حتى المرحلة الزورق في وقت متأخر خارج HP التبديل 12. وهذا يسمح التصوير الحي من العمليات الحيوية في الحيوانات المنوية، وعلى سبيل المثال، الخلايا المنوية تدخل الانقسامات الانتصافي (الشكل 5 و الفيديو التكميلي 2). لهذه التجربة، تم استخدام الموسومة RFP هيستون البديل H2AvD كما كروموسوم علامة. المرحلة الابتدائية خلية نطفية تمتد لحوالي 3 أيام في الجسم الحي 31. ولذلك، من أجل تسجيل الانقسامات الانتصافي، اخترنا الخراجات مع الخلايا المنوية التي بدأت بشكل واضح التكثيف لونين (الشكل 5A، والمنطقة 2). يبدأ الميتوزي في الخلايا المنويةعلى جانب واحد من الكيس ثم يلي في موجة في الخلايا المنوية المتبقية (في الشكل 5A من المنطقة 2 إلى المنطقة 1، انظر أيضا الفيديو التكميلي 2). التكثيف من لونين قريبا يؤدي إلى الكروموسومات سريعة الحركة التي هي واضحة والنقاط المضيئة (الشكل 5A، والمنطقة 2). بعد 30 دقيقة، والخلايا المنوية الأولى من هذه المنطقة موجودة بالفعل في الطور النهائي (الشكل 5B، النصال). الكروموسومات في المنطقة الأصغر 1 ترتب على لوحة الطورية 20 دقيقة في وقت لاحق (الشكل 5C). أنها الطور النهائي الكامل ونحن على استعداد للخضوع الانقسام السيتوبلازمي حوالي 15 دقيقة في وقت لاحق (الشكل 5D). طور الصعود، واستمر الطور النهائي، والانقسام السيتوبلازمي حوالي 10 دقيقة في هذا التسجيل (الفيديو التكميلي 2). في الثدييات، وكذلك في ذبابة الفاكهة، زيادة واضحة في أستلة H4 هيستون تمثل بداية إزالة هيستون والتبديل HP خلال مرحلة ما بعد الانتصافي6،11 الحيوانات المنوية. وقد اقترح أن هذا التعديل الجيني هو عنصر أساسي أو حتى الزناد من البرنامج التنموي للتبديل HP 10،32. سابقا، كنا نعامل وذبابة الفاكهة الخصيتين العذراء في الثقافة مع مثبطات تستهدف القبعات وHDACs للتأثير على مستوى أستلة هيستون H4 خلال مراحل ما بعد الانتصافي 12. في هذه المقايسات الدوائية، وجدنا أن أستلة هيستون ضروري لتطور الحيوانات المنوية من المراحل مع الكروماتين القائمة على هيستون إلى مراحل مع الكروماتين القائمة على بروتامين. أرقام 6 و 7 تظهر نتائج ممثلة من مقايسة الدوائي باستخدام حمض اناكارديتش لاستهداف القبعات في الخصيتين العذراء. تم تشريح الخصيتين في 24 ساعة APF من سلالة ذبابة معربا عن H2AvD-RFP وProtamineB-EGFP. كان البروتين ProtamineB-EGFP غائبة في هذه الخصيتين العذراء في وقت مبكر (الشكل 6A و B). بعد 24 ساعةص في الثقافة، وأظهرت الخصيتين تحكم إشارات ProtamineB-EGFP، الذي أشار إلى أن الخراجات الأولى قد وضعت خارج HP التبديل (الشكل 6A، النصال مفتوحة). لم يكن هذا هو الحال مع الخصيتين تعامل مع 150 ميكرومتر حمض اناكارديتش (الشكل 6B). الخصية الاستعدادات الاسكواش والتحليلات المناعي تقدم معلومات أكثر تفصيلا (الشكل 7). في السيطرة غير المعالجة، ونوى الخلايا المنوية الأولية وكبيرة نسبيا يمكن أن يعترف بها نمط مميز من ثلاث مناطق من الحمض النووي الملون غنية، والتي تتوافق مع الكروموسومات الرئيسية (مستوى 4C) من ذبابة الفاكهة (الشكل 7A، العمود 1). أستلة H4 هيستون هو كشفها بوضوح في هذه المرحلة (الشكل 7B، العمود 1). المرحلة الأولى بعد الانقسامات الانتصافي كما هو معروف مرحلة جنيبة النواة ويتميز كبيرة نوعا ما، نواة مستديرة (انظر الشكل 4C، ليس هو مبين في الشكل 7). يتم التعرف على المرحلة المقبلة هو مبين في الشكل 7 النمو سوطي وشكل دائري من نواة الخلية الجرثومية، والتي هي بالفعل أصغر بكثير مما كان عليه في المراحل السابقة (الشكل 7A، العمود 2)، وتظهر منخفض جدا إلى مستويات غير قابلة للكشف تقريبا H4 هيستون أستلة (الشكل 7B، العمود 2). على شكل دائري ثم يستطيل (الشكل 7A، العمود 3)، وأستلة H4 هيستون هو بوضوح مرة أخرى كشفها (الشكل 7B، العمود 3). وspermatids ثم تصل إلى المرحلة التي شكل الزورق في التحول HP يحدث ويتم استبدال الهستونات بواسطة protamines (أرقام 7A – 7 C، والأعمدة 4 و 5). بعد مرحلة الزورق، ثم نوى protaminated مزيد استطال في شكل إبرة رقيقة جدا في الحيوان المنوي الناضج (غير مبينة هنا). أظهرت الاستعدادات الخصية الاسكواش من الخصيتين تعامل مع حمض اناكارديتش مختلف النتائج (أرقام 7D </ قوي> – 7 F). لونين في الخلايا الجرثومية تعامل مع حمض اناكارديتش بدا أكثر مكثف من ذلك من السيطرة غير المعالجة (قارن الشكل 7D، وتعامل و7A، السيطرة). وقد أظهر تحليل النتائج المناعي أن أستلة H4 وتضاءلت إلى حد كبير أو حتى غائبة في نوى الخلايا الجرثومية تعامل مع حمض اناكارديتش (الشكل 7E). من المعروف أن الأسيتيل الهستونات غاية ترتبط مع مناطق الكروماتين مفتوحة، بينما المناطق التي تفتقر لونين هيستون أستلة كثيرا ما تظهر بنية القمعي 33. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن العلاج مع حمض اناكارديتش أثرت على هيكل لونين من نواة الخلية الجرثومية المعالجة. الأهم من ذلك، تم تحديد أي نوى-بروتامين الإيجابي للمرحلة أواخر الزورق أو بعده في الخصيتين المعالجة (الشكل 7F). وبالتالي، بياناتنا تتفق مع فكرة أن النشاط HAT ضروري لتكون النطاف بالمضي قدما جيئة وذهاباالكروماتين إلى مراحل الكروماتين القائمة على بروتامين م هيستون القائم. الرقم 1. نظرة عامة على ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية. تعرض اللوحة اليمنى تسلسل مراحل في تطور الخلايا الجرثومية من الخلايا الجذعية إلى الحيوانات المنوية الفردي. تظهر رسومات تخطيطية التشكل النووي مميزة من الخلايا الجرثومية. واحد spermatogonium يقسم لإنتاج الخلايا المنوية 16 المترابطة في كيس واحد. خلال هذه المرحلة يتم إنتاج معظم النصوص المطلوبة للتنمية بعد الانتصافي، مكبوت translationally، وتخزينها. الجزء الأكبر من النشاط النسخي ينتهي سريان الانقسامات الانتصافي. مفتاح هيستون إلى بروتامين في لونين يحدث بين مرحلة الزورق المبكرة والمتأخرة. مراحل مع الكروماتين القائمة على هيستون مرتفعةمضاءة باللون الأحمر. ويسلط الضوء على مراحل مع الكروماتين القائمة على بروتامين باللون الأخضر. القضبان في اللوحة اليمنى تشير المراحل من الخلايا الجرثومية التي يمكن أن توجد عادة في الخصية النامية في يرقات، عذارى في حوالي 24 و 36 ساعة بعد تشكيل puparium (APF)، والذباب الكبار. الرقم 2. الخصيتين ذبابة الفاكهة في مراحل مختلفة من التنمية. (A) صورة المرحلة النقيض من كل جبل الخصية ممرود قليلا من يرقة الطور الثالث، (L3). يمكن العثور على المراحل السابقة للالانتصافي والانتصافي فقط. تقتصر أمهات المني إلى الطرف الأمامي تحت منطقة مركز (النجمة). يتم تعبئة الخصية المتبقية مع الخلايا المنوية (السهم مفتوح). (B) صورة المرحلة النقيض من الخصية ممرود قليلا في كاليفورنيا. 24 ساعة بعد تشكيل puparium (APF). بالإضافة إلى الخلايا المنوية (السهم فتح)، الخصية تحتوي spermatids في المرحلة جنيبة النواة (النصال مفتوحة)، مع نواة مستديرة وspermatids في التمطيط مراحل مع تزايد سياط (رأس السهم مفتوحة مزدوج) (C – E). الجامع جبل الخصيتين العذراء التعبير H2AvD-RFP وProtamineB-EGFP (تراكب من مرحلة التباين وEGFP والصور مضان RFP). (C) الخصية تشريح العذراء في حوالي 24 ساعة APF. رأس السهم يمثل صناعة السيارات في مضان من خلايا الدهون في الجسم المفترضة. D) العذراء الخصية تشريح في كاليفورنيا 36 ساعة APF يعرض أول الكيس ProtamineB-EGFP إيجابية (السهم). (E) العذراء الخصية في حوالي 48 ساعة APF مع مجموعة من الخراجات ProtamineB-EGFP إيجابية (السهم). في جميع أجزاء الشكل، وتشير العلامات النجمية المنطقة مركزا. أشرطة النطاق: 100 ميكرون.عنخ "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 3. التصوير لايف للتبديل هيستون، لبروتامين في الخصية العذراء متزايد خارج الحي. (A) صورة المرحلة النقيض من الخصية العذراء معربا عن H2AvD-RFP وProtamineB-EGFP تؤخذ في الثقافة في كاليفورنيا 45 ساعة بعد تشكيل puparium (APF). يشار إلى الحويصلة المنوية بواسطة سهم شغلها. وparagonium (رأس السهم المزدوج) لا تزال تعلق على الخصية. (A ') EGFP وRFP مضان من الخصية هو مبين في (A). السهم مفتوحا يشير إلى الكيس-ProtamineB EGFP إيجابية. شريط مقياس: 100 ميكرون (B) بعد 2 ساعة و 30 دقيقة في الثقافة، والعديد من الخراجات أخرى (السهم مفتوح) تظهر الابام الانتقال هيستون، لبروتامين. (C) بعد حوالي إضافية 3 ساعة في الثقافة، أي ما مجموعه 5 ساعة 29 دقيقة في الثقافة، مجموعة من الكيسات (السهم مفتوح) مع إشارة قوية ProtamineB-EGFP مرئيا في نهاية القريبة من الخصية. انظر أيضا التكميلي الفيديو 1. في جميع أجزاء الشكل، وتشير العلامات النجمية المنطقة مركزا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 4. الخراجات المعزولة من الخلايا الجرثومية في مراحل مختلفة من التنمية. (A) الخراجات تشريح من الخصية في حوالي 24 ساعة بعد تشكيل puparium (APF). تراكب على النقيض من المرحلة ومضان H2AvD-RFP (الحمراء) الصور. شريط مقياس: 100 ميكرون.(B – E) تكبير الخراجات واحدة من مراحل مختلفة. تراكب من النقيض تدخل الفرق (DIC) والصور مضان H2AvD-RFP. شريط النطاق: 20 ميكرومتر (B) الكيس من 16 المنوية (C) الكيس من 64 spermatids جولة في مرحلة جنيبة النواة. هيكل جنيبة النواة يتطور من الميتوكوندريا تنصهر ومرئيا في الصور DIC بجانب النواة (رأس السهم مفتوح). (D) الكيس من spermatids مع نواة الجولة H2AvD-RFP إيجابية والتمطيط سياط (رأس السهم مفتوحة يدل على وجود هيكل جنيبة النواة التمطيط التي ترافق الخيط المحوري المتزايد). (E) تقلب قمي من كيس من spermatids في مرحلة مبكرة الزورق تظهر على شكل النووي ممدود. وسياط ممدود على نطاق واسع مرئية جزئيا فقط. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا وigure. الشكل 5. التصوير لايف من واحد كيس 16 خلية نطفية تمر الانقسام المنصف أنا خارج الحي. الصور الإسفار من كيس في الثقافة معربا عن H2AvD-RFP. يصور مراحل هي سمة من الانقسام الاختزالي الأول المنوية في كيس تمر عبر الانقسامات الانتصافي بطريقة تشبه الموجة. يبدأ (A) كروموسوم التكثيف في نوى في جانب واحد من الكيس (2) وتقدم من خلال الكيس (الاتجاه الذي يشير إليه السهم ). نوى في المنطقة معارضة (1) تمثل مرحلة مبكرة من التكثيف لونين، حيث مناطق كثيفة هيستون بمناسبة الكروموسومات الثلاثة الكبرى لا يزال من الممكن تمييزها. الخلايا المنوية في المنطقة (2) تحتوي على الكروموسومات المختصرة بالكامل، واضحة كبقع مضيئة الفلورسنت. (B) بعد 300، دقيقة، والخلايا المنوية الأولى في المنطقة (2) هي في الطور النهائي (النصال مفتوحة)، بينما يستمر الكروموسوم التكثيف في المنطقة (1) (C) في الخلايا المنوية مشاركة من المنطقة (1)، يتم ترتيب الصبغيات (السهام). في لوحة الطورية 20 دقيقة في وقت لاحق. (D) في غضون 15 دقيقة أخرى، تظهر الخلايا المنوية مشاركة لإكمال الطور النهائي وجاهزة الآن للخضوع الانقسام السيتوبلازمي (النصال مفتوحة). انظر أيضا التكميلي الفيديو 2 شريط الحجم: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 6. حمض اناكارديتش يمنع التبديل هيستون، لبروتامين في الخصيتين العذراء مثقف. الخصيتين العذراء expressi وحضنت نانوغرام H2AvD-RFP وProtamineB-EGFP وتشريح في 24 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) لمدة 24 ساعة في المتوسط ​​دون المانع (السيطرة؛ A، A '؛ DMSO، ديمثيلكبريتيد) أو في المتوسطة تستكمل مع 150 ميكرومتر حمض اناكارديتش ( B، B '). المناطق المشار إليها مركزا العلامات النجمية. (A، B) لا الخراجات-ProtamineB EGFP إيجابية يمكن ملاحظتها بعد تشريح. (A ') بعد 24 ساعة من الحضانة، خضعت بعض الخراجات للهيستون لبروتامين التبديل وProtamineB-EGFP إيجابية ويمكن ملاحظة الخراجات (النصال مفتوحة). (B ') الخصية تعامل مع حمض اناكارديتش لا تتطور الخراجات ProtamineB-EGFP إيجابية. شريط مقياس: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 68 / 51868fig7highres.jpg "العرض =" 500 "/> الرقم 7. حمض اناكارديتش يؤثر هيستون أستلة H4 وهيكل لونين من spermatids الاستعدادات الاسكواش من نوى spermatid من الخصيتين العذراء (24 ساعة APF) معربا عن ProtamineB-EGFP حضنت لمدة 24 ساعة دون المانع (A – C). أو مع 150 ميكرومتر حمض اناكارديتش (D – F). DNA ملطخة هويشت صبغ (A و D). أستلة H4 تحليل immunofluorescently (B و E). بحضور protamines رصدها مع الإشارة ProtamineB-EGFP (C و F). بعد العلاج مع حمض اناكارديتش، يبدو أن الكروماتين ضغط بقوة (D) ويتم تقليل إشارة أستلة H4 تماما في جميع مراحل spermatid (E). بالإضافة إلى ذلك، المعاملة حمض اناكارديتش، وتظهر الخصيتين لا الخراجات من أواخر مرحلة الزورق أو بعده وعدم وجود إشارة ProtamineB-EGFP (F). شريط النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. تكميلية فيديو 1. تصوير مباشر عبر EGFP وRFP مضان من التبديل هيستون، لبروتامين في الخصية العذراء خارج الحي. فيديو 6 ساعة دوام التصوير المتزايد يوضح الانتقال هيستون، لبروتامين من الزيادة في انتشار ProtamineB- الخراجات EGFP إيجابية. تم الحصول على الصور كل 5 دقائق. لمزيد من التفاصيل، انظر الشكل 3 (انظر "suppl_video_1.MOV" في إطار التنزيل). تكميلية فيديو 2. التصوير لايف من 16 المنوية كيس تمر الانقسام المنصف واحد أنا خارج الحي. الوقت الفاصل بين التصوير الفلورسنت لكيس في التعبير عن الثقافة H2AvD-RFP على مدار 80 دقيقة. يصور هذا الفيديو تم الحصول مراحل مميزة من الانقسام الاختزالي الأول كل صور 1 دقيقة. لمزيد من التفاصيل، انظر الشكل 5 (انظر "suppl_video_2.MOV" في إطار التنزيل).

Discussion

يصف بروتوكول المعروضة اثنين من التطبيقات المختلفة على حد سواء على القدرة على تشريح الخصيتين ذبابة الفاكهة والخراجات واحد خط الجرثومية في مرحلة تنموية معينة، وعلى تطوير فيفو السابقين من هذه الخلايا والأنسجة في صحن الثقافة. طلب واحد هو التلاعب الدوائية من العمليات الحيوية خلال تطوير الحيوانات المنوية. الأهم من ذلك، هذا يسمح بالوصول إلى تكوين الحيوانات المنوية بعد الانتصافي الذي لا كسب بسهولة باستخدام تحليلات وظيفية على أساس الوراثة الطاير. التطبيق الآخر هو مراقبة مجهرية المعيشة وتطوير الخلايا التناسلية والخصيتين. خاصة هذا التطبيق الاستفادة من قدرة خلايا ذبابة الفاكهة والأعضاء في الثقافة من أجل البقاء والتطور في RT وتحت الغلاف الجوي العادي. وبالتالي، مجهر التصوير مقلوب مجهزة مرحلة ساخنة (التسخين لدرجة حرارة تربية القياسية من 25 درجة مئوية) كافية للحصول على نتائج ذات مغزى في التجارب الحية التصوير. وعلاوة على ذلكأكثر من ذلك، العديد من السلالات المعدلة وراثيا ذبابة معربا عن البروتينات الموسومة بروتين فلوري للتصوير الحية موجودة أو يمكن أن تنشأ بسهولة.

للحصول على الخصيتين العذراء أو الخراجات خط الجرثومية من مرحلة تنموية محددة، فمن الأهمية بمكان أن واحد هو مألوف مع توقيت وضع ذبابة الفاكهة. التوقيت الدقيق لكل مرحلة قد تختلف بين المختبرات والظروف والثقافة، ويطير السلالات ويجب وضع تجريبيا. على النحو المبين أعلاه، وهذا مهم خاصة بالنسبة للفحوصات الدوائية، على سبيل المثال، استهداف التبديل HP. لمثل هذه التجارب، فإنه من المستحسن للتحقق دائما لspermatids مع إشارة ProtamineB-EGFP قبل الاختبار الفعلي المانع لأن توقيت يمكن أن تختلف قليلا حتى داخل احد السكان.

بعد بروتوكول أعلاه يجب أن تمكن المجرب لتشريح الخصيتين من مراحل العذراء مبكرة كأجهزة سليمة خالية من تعلق أنسجة الجسم الدهنية. هذه الخصيتين، وحتى أكثر من ذلك، عزل جنرال الكتريكالخراجات خط RM-هشة جدا. وبالتالي، من الأهمية بمكان لتطوير البراعة اليدوية والخبرة اللازمة لمناولة ونقل الخصيتين والخراجات باستخدام ملقط، والإبر، والماصات. خاصة الدراسات التي تستهدف تطوير بعد الانتصافي الخلية الجرثومية الانتصافي وأوائل ستستفيد من هذا. في حين أنه من السهل نسبيا لتشريح الخراجات من spermatids أواخر مع سياط طويلة من الخصيتين الكبار، فمن الصعب الحصول على المراحل السابقة. تشريح هذه الأكياس من الخصيتين العذراء في وقت مبكر بعد هذا البروتوكول هو أكثر كفاءة بكثير. نضع في اعتبارنا أن في سلالة ذبابة المعتاد، فقط حوالي 50٪ من الشرانق سوف يكون من الذكور. لذلك، وإعداد لتشريح على الأقل ضعف عدد الشرانق حيث بلغ عدد الخصيتين المطلوبة. بدلا من ذلك، فمن الممكن لتحديد الذكور L3 اليرقات باستخدام مجهر ستيريو، كما يمكن التعرف على الخصيتين أجهزة مستديرة شفافة وجزءا لا يتجزأ في أنسجة الجسم الدهون الجانبية لليرقة سليمة 23،34، وجمعها في قارورة الثقافة الجديدة التي يمكناستخدامها لالتقاط ما قبل الشرانق للانطلاق والتشريح. ومن الممكن أيضا لتحديد الذكور قبل الشرانق 35.

لاحظنا أن كلا من الخراجات خط الجرثومية المعزولة والخصيتين العذراء سليمة في الثقافة حساسة للضوء، كما تم أيضا ذكر سابقا 18. هذه الحساسية الخفيفة قد عقد أيضا لبعض المركبات الكيميائية المستخدمة في المقايسات الدوائية. لذا، فمن الأفضل للحفاظ على أطباق ثقافة مقايسة في الظلام أثناء الحضانة. وبالمثل، عند تخطيط التجارب الوقت الفاصل بين التصوير مع الخصيتين النامية، وخاصة الأكياس المعزولة، أن نضع في اعتبارنا أن أوقات التعرض طويلة جدا و / أو معدلات عالية جدا أخذ العينات قد تحول دون تطوير فيفو السابقين. ينبغي تحديد معدل أخذ العينات المناسبة تجريبيا.

العدوى البكتيرية و / أو الفطرية والإفراط في النمو في أطباق ثقافة يشكل مشكلة خطيرة. أطباق ثقافة المصابين عدد كبير جدا من البكتيريا لا تدعم فيفو السابقين ديفيlopment من الخصيتين والخراجات. ولذلك، فإن مستنبت وصف يحتوي البنسلين والستربتومايسين (راجع الخطوة 1.1)، ولكن خلال فترة الحضانة على المدى الطويل، يمكن أن تتحلل هذه المضادات الحيوية والنشاط التي قد تقلل. هذا يمكن أن يكون أحد الأسباب لفترة محدودة للبقاء (بحد أقصى 72 ساعة) من الخراجات مثقف لوحظ عند استخدام بروتوكول أعلاه. بعد هذا الإطار الزمني لا يمكن مدد استبدال العادية من مستنبت في أطباق. نستنتج أن هناك عوامل أخرى قد تؤثر على بقاء في الثقافة، مثل عدم وجود إشارات النمو من الأنسجة الأخرى من الجهاز التناسلي. من ناحية أخرى، والتنمية بعد الانتصافي هي ذبابة الفاكهة في أسرع منه في الثدييات. في ذبابة الفاكهة، تكون النطاف يستغرق حوالي 90 ساعة، والتبديل HP يقام بين 50 و 60 ساعة بعد الانقسام المنصف 9،12. وهكذا، فإن بقاء الوقت المعتاد لحوالي 48 ساعة يتحقق مع هذا البروتوكول هو مناسبة تماما لمتابعة العمليات التنموية المحورية في جمعية مهندسي البترولrmatogenesis، مثل الانقسامات الانتصافي أو التبديل HP. على الرغم من التلوث الجرثومي أو الفطري يمكن تجنبها باستخدام أدوات نظيفة وسائل الإعلام، وبروتوكول المقدمة لا الاستفادة من ظروف العمل معقمة بدقة بسبب الذباب وذبابة الخصيتين يحتوي بالفعل البكتيريا عندما المثارة في إطار الظروف القياسية. ومع ذلك، بعض التطبيقات لهذه التقنية الثقافة قد تستفيد من الذباب تشريح أو حتى أثار تحت ظروف معقمة (لبروتوكولات، انظر 17،36،37).

المقايسات الدوائية تعتمد على استخدام مركبات كيميائية تعمل باسم مثبطات أو تفعيل الإنزيمات المختلفة. المركبات التي تستخدم عادة في مثل هذه التجارب كثيرا ما تختلف على نطاق واسع في خصوصية المستهدفة. وميزة، وهذا يوفر القدرة على استهداف الطبقات انزيم بأكملها، على سبيل المثال، مع حمض اناكارديتش تثبيط P300 / الجمارك وحماية الحدود، PCAF، وأفراد الأسرة MYST من القبعات 38. الجانب السلبي من هذا يمكن أن يكون بعيدا عن الهدف المحتمل أو الآثار السامة للخلايا inducإد من هذه المركبات. ولذلك، ينبغي اختبار كل مركب يستخدم في فحص الخصيتين مع العذراء أو الخراجات من أجل سمية الخلايا وتأثير محدد بتركيزات مختلفة. وعلاوة على ذلك، هناك اختلافات طفيفة في الظروف والثقافة، وتركيز مركب أو النشاط، والتغيرات في نفاذية الخلية قد يؤدي إلى تنوع الآثار التي يسببها. وبالتالي، فمن الضروري مراقبة نجاح العلاج في كل تجربة. على سبيل المثال، عندما كنا حمض اناكارديتش في 150 ميكرومتر، لاحظنا التغير الطفيف في قوة النمط الظاهري بين لونين التكثيف وأحيانا داخل بعض الخصيتين، في حين انخفض أستلة هيستون H4 باستمرار.

وقد استخدمت المقايسات الدوائية مع الخصيتين ذبابة الفاكهة في الثقافة لتحليل آليات ما قبل وما بعد الانتصافي من الحيوانات المنوية 4،12،14،21. لأنه من الصعب الوصول إلى الحيوانات المنوية بعد الانتصافي مع الأدوات الوراثية لاستهداف اللاعبين مع ضروريهوظائف لتر قبل الانتصافي والانتصافي، وهذا النهج فيفو السابقين يشكل بديلا. وعلاوة على ذلك، من حيث المبدأ، يمكن تكييف طريقة لنبض مطاردة تجارب لمتابعة تطور الخلايا الجرثومية تعامل مع مرور الوقت. ومع ذلك، فإننا لم تختبر بعد هذا الاحتمال. الاستفادة من وقت مبكر الخصيتين العذراء هي ميزة في المقايسات الدوائية. أولا، يمكن للغمد الخارجي رقيقة من الخصيتين العذراء الشابة (حوالي 24 ساعة APF) تسمح تحسين نفاذية من المركبات الكيميائية. ثانيا، عند دراسة HP التبديل بعد الانتصافي، الخصيتين العذراء تشريح في 24 ساعة APF من خط الطيران معربا عن بروتامين-GFP تمكين قراءات مباشرة ما إذا كان تأثر التبديل HP أم لا.

حتى الآن، وقد وضعت عدة بروتوكولات لخارج الحي زراعة الأعضاء والأنسجة بما في ذلك الخصيتين والخراجات خط الجرثومية ذبابة الفاكهة (على سبيل المثال، انظر 4،14،17،20،39،40). وسيلة زراعة والظروف العامة المستخدمةفي البروتوكول المقدمة هنا تم تأسيسها في عام 1979 17. وقد تم تكييف نظام الثقافة في وقت لاحق في الجسم الحي التصوير آلية الفردية في الخراجات ما بعد الانتصافي أواخر معزولة عن الخصيتين الكبار 4. سابقا، كنا قد ذكرت أن هذه الظروف أيضا أن تدعم بقاء وتمايز الخلايا الجرثومية الانتصافي وبعد الانتصافي مبكرة في الخراجات من أجل حوالي 48 ساعة 12. على النقيض من نظم الاستزراع الأخرى 19 كان توقيت التنموي لوحظ في هذه الثقافات يتفق تقريبا مع توقيت تحديده من عينات ثابتة (لمزيد من التفاصيل، انظر 12). H2AvD-RFP وبروتامين-GFP مضان إشارات يمكن استخدامها لتصور التشكل وتكوين الكروماتين النووي للخلايا الجرثومية في الثقافة. وجدنا أن لتحديد واضح لمراحل النمو في الثقافة، وهذا هو المفيد على معايير أخرى، مثل اللف الخراجات. الأهم من ذلك أن بروتوكول المقدمة لا تشمل إضافة ذبابة تحويلةract عوامل النمو الأخرى أو غيرها من مصل بقري جنيني. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا هنا أن الظروف متوافقة مع التصوير المجهري مضان من الانقسامات الانتصافي فيفو السابقين في الثقافة. ويمكن الحصول على صور لقرار معقول في وسيلة سهلة الاستخدام التي تدعم التنمية على المدى الطويل. هذا هو على النقيض من بروتوكولات تمكين المدى القصير (حوالي 3 ساعة) الملاحظات في زيت Voltalef 41،42.

الإجراءات المذكورة أعلاه للزراعة والعلاج الدوائي من الخصيتين العذراء واحدة الذكور الخراجات خط الجرثومية قابلة للتكيف بسهولة إلى العديد الجيني، جينية، بيولوجية الخلية، أو أسئلة التنموية التي يمكن بحثها في ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية. ويشمل ذلك خصوصا الأبحاث التي تركز على الخلايا الجذعية خط الجرثومية. وقد تبين أن تنمية الخلايا الجذعية يمكن أن تتبعها التصوير الحي من البالغين مثقف الخصيتين 20،43. ومع ذلك، فإن حركة تمعجية من الخصية الناضجة sheatح يتداخل مع الحصول على الصور. لذلك، ويتم التصوير باستخدام إما مجزأة 43 الخصيتين أو عدد من التجارب أجريت التصوير لابد من زيادة لحساب مجموعات البيانات المفقودة 20. الخصيتين العذراء في وقت مبكر (24 ساعة APF) لم ترفق بعد مع خلايا العضلات. حتى قليلا تظهر الخصيتين القديمة (36-45 ساعة APF) لإظهار بعض الحركات تحوي (قارن الشكل 3 والفيديو التكميلي 1). وبالتالي، يمكن زراعة الخصيتين العذراء الشابة كأجهزة سليمة تخدم كبديل.

وعلاوة على ذلك، يتقن مرة واحدة، والقدرة على تشريح الخصيتين العذراء وسوف في نهاية المطاف معزولة الخراجات خط الجرثومية تسمح تطبيقات أخرى باستخدام الأكياس واحدة كمصدر للمتجانس، ولو صغيرة، والسكان الخلية. على سبيل المثال، بالتالي فمن الممكن أن تؤدي RT-QPCR لتحليل التنظيم النسخي من جينات معينة خلال مراحل محددة من الحيوانات المنوية، كما سبق أن برهنت <suص 15>.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Materials

Anacardic acid Merck Millipore 172050 brand: Calbiochem (EMD Millipore)
Anti-acetyl-Histone H4 Merck Millipore 06-598 brand: Upstate
AxioCam MRm  Zeiss
AxioObserver.Z1 inverted microscope Zeiss
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Dumont 5-Inox forceps Dumont multiple suppliers
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Sigma F4135
Fiber optical  illuminator multiple suppliers
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek P35G-1.5-14-C
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 Dianova 711-175-152
Hoechst Sigma B1155
Inoculation loop or pin holder multiple suppliers
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 Plano GmbH N5018 In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm Plano GmbH N5014
Multiwell plates, 24-wells Becton Dickinson 351147 brand: Falcon
Pen Strep invitrogen 15070 brand: Gibco
Shields and Sang M3 Insect Medium Sigma S8398
Stemi SV6 binocular Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
  2. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
  3. Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).
  4. Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
  5. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
  6. Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
  7. Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
  8. Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
  9. Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. , (2013).
  10. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  11. Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
  12. Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
  13. Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
  14. Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
  15. Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. Post-meiotic transcription in Drosophila testes. Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).
  16. Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
  17. Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
  18. Rebollo, E., González, C., Henderson, D. S. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).
  19. Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
  20. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
  21. Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
  22. Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
  23. Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
  24. Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
  25. Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).
  26. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).
  27. Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).
  29. Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
  30. Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
  31. Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
  32. Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
  33. Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K. Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).
  34. Demerec, M., Kaufmann, B. P. . Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).
  35. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  36. Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
  37. Meynadier, G., Vago, C. . Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).
  38. Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
  39. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  40. Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
  41. Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
  42. Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
  43. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).

Tags

DrosophilaPupal TestisEx Vivo CultureGerm-line CystsSpermatogenesisPost-meioticHistone-to-protamine SwitchPharmacological TreatmentMicroscopic Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Gärtner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment. J. Vis. Exp. (91), e51868, doi:10.3791/51868 (2014).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image