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Neurociencias

Unilateral Pyramidotomy del Tracto corticoespinal en ratas de Evaluación de Terapias Neuroplasticity inductores

Published: December 15, 2014
doi:
10.3791/51843
, , , , ,
1Neurorestoration, Wolfson Centre for Age-Related Diseases,King’s College London, 2Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

El tracto corticoespinal, una de las principales vías sensoriomotoras, puede ser lesionada unilateralmente en el tronco cerebral de roedor con el fin de probar terapias de inducción de neuroplasticidad para el sistema nervioso central. Este procedimiento quirúrgico ("pyramidotomy") y las evaluaciones postoperatorias se describen en este protocolo.

Abstract

El tracto corticoespinal (CCT) puede ser completamente cortado unilateralmente en las pirámides medulares del tronco cerebral de los roedores. El CST es un tracto motor que tiene gran importancia para el control muscular distal en los seres humanos y, en menor medida, en los roedores. Un corte unilateral de una pirámide resultados en pérdida de CST inervación de la médula espinal, principalmente en el lado contralateral de la médula espinal que conduce a discapacidad motora transitoria en las extremidades anteriores y sostenida pérdida de destreza. Proyecciones ipsilateral del tracto corticoespinal son menores. Hemos perfeccionado nuestro método quirúrgico para aumentar las posibilidades de exhaustividad lesión. Describimos el cuidado postoperatorio. Los déficits en la prueba Montoya escalera pellet alcance y la prueba escalera horizontal que se muestra aquí se detectan hasta 8 semanas después de la lesión. Los déficits en la prueba de cría cilindro sólo se detectan de forma transitoria. Por lo tanto, la prueba del cilindro sólo puede ser adecuado para la detección de la recuperación a corto plazo. Mostramos cómo, electrofisiológicamentey anatómicamente, se puede evaluar lesiones y cambios plásticos. También describe cómo analizar fibras de la CST ileso brotan a través de la línea media en las zonas desfavorecidas. Es difícil obtener> 90% lesiones completas constantemente debido a la proximidad a la arteria basilar en el bulbo raquídeo y las tasas de supervivencia pueden ser bajos. Abordajes quirúrgicos alternativos y pruebas de comportamiento se describen en este protocolo. El modelo pyramidotomy es una buena herramienta para la evaluación de los tratamientos que inducen neuroplasticidad, que aumentan la brotación de las fibras intactas después de la lesión.

Introduction

El tracto corticoespinal (CCT) es uno de los principales vías motoras en la médula espinal humana. El daño a este tratado después de los resultados de lesiones de la médula espinal en una considerable pérdida de destreza. El CST es especialmente importante para el movimiento de la motricidad fina en los seres humanos, como el movimiento dígitos y el control muscular distal. También se encuentra en roedores aunque su localización anatómica dentro de la médula espinal es diferente a la de los seres humanos y los daños CST es menos incapacitante 1-4.

Un modelo in vivo de lesión CST implica pyramidotomy unilateral, donde una pirámide en el tronco cerebral ventral se corta rostral a la decusación (Figura 1). Las pirámides son una característica anatómica clara en la parte ventral del bulbo raquídeo a través del cual la CST se ejecuta antes de que decussates. En ratas, la mayoría de las fibras (alrededor de 95%) decussate en el extremo caudal de la médula y se encuentran a partir de entonces en la parte medial dorsal de la médula espinal. Sin embargo, approximately 10% de las fibras decussated ejecuta en las columnas dorsolateral. El restante ~ 5% de fibras de quedarse sin cruzar en el lado ipsilateral y viajar en la parte medial ventral 5,6. Después pyramidotomy la médula espinal pierde su aportación directa de la contralateral CST (Figura 1).

El modelo pyramidotomy es particularmente bueno para probar las respuestas de las fibras intactas de la CST no lesionado a un tratamiento. Se permite la evaluación de la plasticidad y la germinación de las fibras intactas a través de la línea media en la médula espinal, que inervan las áreas denervado. El tracto corticoespinal se ha observado a brotar considerablemente en modelos de lesión de la columna vertebral y media 7-10 recuperación, especialmente extremidad anterior. Un tratamiento podría apuntar a mejorar la recuperación de la extremidad anterior. La eficacia de una terapia se puede probar con las evaluaciones de comportamiento, técnicas de rastreo anatómicas de las vías no lesionado y terminales experimentos electrofisiológicos 3,11,12. </ P>

La ventaja en comparación con la mayoría de los otros modelos preclínicos de lesiones de la médula es que afecta específicamente un tracto en comparación con otras lesiones de la médula a menudo afectan a múltiples extensiones. Sólo un tracto en una ubicación anatómica superficial claro está lesionada. Otra ventaja es que el pyramidotomy es un modelo de lesión reproducible. Es un recurso adecuado en vivo para los investigadores probar el efecto de potenciales terapias neuroplasticidad inductores, cuyo objetivo es la recuperación de la función motora después de lesiones o trastornos que afectan el sistema motor 13,14.

Protocol

Declaración de Ética: Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con las directrices del Ministerio del Interior británico y Animales (Procedimientos Científicos) Ley de 1986. 1. Cirugía y Lesiones NOTA: El uso de las ratas más pesados ​​que 220 g pueden ayudar con la recuperación postoperatoria si el cirujano encuentra animales a menudo pierden más del 10% de su peso corporal preoperatorio. Antes de la cirugía, prueba los animales por su preferencia pata con la prueba de la cría de cilindro 15 o prueba el Montoya staicase 24. Preferiblemente, cortó la pirámide / CCT correspondiente a la pata delantera dominante. NOTA: Durante dos días antes de la cirugía, coloque los siguientes elementos en las jaulas, por lo que las ratas se familiarizan con los alimentos que serán beneficiosos durante la recuperación de la cirugía: los paquetes de hidrogel, puré húmedo, y los altos suplementos alimenticios calóricos. Versiones estériles de estos complementos alimenticios son de diferentes suministradores. Anestesiar femenina Lratas ister capucha (que pesan entre 200 y 250 g) con isoflurano (5% para la inducción y 1 a 2% para el mantenimiento) en oxígeno (caudal: 1,5 l / min). NOTA: La elección del anestésico es importante. Anestésicos por inhalación, permite una regulación más rápida de la profundidad de la anestesia de ketamina, que también se utiliza comúnmente. El isoflurano permite un mejor control de la frecuencia de la respiración y profundidad. La elección del anestésico es isoflurano. NOTA: El uso de las ratas más pesados ​​que 220 g pueden ayudar con la recuperación postoperatoria si el cirujano encuentra animales a menudo pierden más del 10% de su peso corporal preoperatorio. Administrar Carprofeno subcutánea como analgésico cuando los animales se anestesiaron para reducir la inflamación y proporcionar analgesia. Nota: El carprofeno se da durante la cirugía pyramidotomy en nuestro laboratorio de acuerdo con el consejo de nuestro veterinario. Los opioides pueden causar más depresión respiratoria durante la cirugía. Mantener los animales en 37 ° C durante la cirugía utilizando un hogarsistema de manta exotérmica y una sonda de temperatura rectal. Confirme anestesia total mediante la comprobación de la retirada reflejo pizca pata y el reflejo de parpadeo. Nota: Opcional: Para contrarrestar los problemas respiratorios durante la cirugía, la intubación y la ventilación podría ser factible. Sin embargo, tenga en cuenta que necesita la tráquea se desplace durante la cirugía. Una vez anestesiados, coloque la rata en una posición supina, afeitar el cuello ventral y esterilizar con 1% toallitas de clorhexidina y / o toallitas con alcohol. Aplicar una manta quirúrgico estéril sobre el animal y mantener el área estéril en todo momento. Una vez anestesiados, coloque la rata en una posición supina, afeitar el cuello ventral y esterilizar con 1% de clorhexidina y alcohol toallitas. Aplicar una manta quirúrgico estéril sobre el animal y mantener el área estéril en todo momento. NOTA: Opcionalmente, la cabeza de la rata se puede fijar en un marco estereotáxico en la posición supina durante la cirugía para desactivar la movilidad de la cabeza, es decir,el hueso occipital. Hacer un 2 a 3 cm de largo incisión en la línea media desde la barbilla hasta casi el final rostral del esternón con un bisturí estéril (# 10). Opcionalmente, se aplican pequeños bulldogs para retraer la piel. Blunt diseccionar las capas superiores de tejido, tal como glándulas (por ejemplo, glándula submaxilar y glándula parótida) y los músculos que cubren la tráquea utilizando acción inversa con tijeras romas y pinzas dentadas. Siempre estar en la línea media. Los tejidos deben separar con facilidad. Una vez que la tráquea se expone, desplazar a un lado. La línea media es visible debajo de ella con dos almohadillas de grasa blanca, marcando la línea media en el extremo rostral. Rostral a las almohadillas de grasa blanca, se alcanza el tejido disección roma hasta que la superficie ventral del cráneo (el hueso basioccipital). Inserte retractores largo dentadas (Longitud de horquilla 5,5 mm o 16 mm) para mantener la tráquea desplazada hacia un lado (máximo 1 cm) y para exponer la base del cráneo. El desplazamiento de la tráquea puede obstruct respiración. NOTA: Para algunos animales, afloje los retractores en varios momentos durante la cirugía para eliminar la tensión en la tráquea, por ejemplo, cada 10 minutos durante 2 min. Retractores de gancho puede usarse en lugar de los retractores de larga dentada para reducir la tensión de desplazamiento. Cauterizar cuidadosamente pequeños vasos sanguíneos visibles en el extremo rostral que va hacia la laringe para evitar el sangrado. NOTA: A fin de evitar la cauterización de los vasos sanguíneos del nervio laríngeo recurrente se extraen cuidadosamente lejos de la pared del tejido antes de que se cauterizan. Ajuste el microscopio para el resto de la cirugía. Retire el periostio que cubre la base del cráneo con unas pinzas finas. Ajuste los retractores para lograr la mejor visión posible para la perforación. Siente la superficie irregular del hueso basioccipital con unas pinzas finas, observando una elevación en la línea media, que cubre la arteria basilar. Rostral, el cráneo se abulta como una ligera convexidad. Dependiendo de qué lado se desea la lesión, perfore un agujero de aproximadamente 1 mm lateral a la línea media en los movimientos medio-lateral. NOTA: Recuerde que la rata está en la posición supina, y su lado izquierdo puede estar en el lado derecho investigadores! Una vez que se hace un agujero, ampliar hacia la línea media con pequeños hacia arriba y hacia abajo-movimientos verticales con el taladro hasta la arteria basilar es claramente visible y ampliar lateralmente durante al menos 2 mm. Asegúrese de que la arteria basilar es claramente visible. La pirámide puede ser identificado por su forma ligeramente abombada (Figura 2) y bordeando los vasos sanguíneos. Retire todos los fragmentos de hueso restantes con unas pinzas finas. Aplicar una gota de clorhidrato de doxapram, un estimulante respiratorio, en la lengua. Abra la duramadre longitudinalmente con una aguja de calibre 26 y unas pinzas finas lateral a la arteria basilar. Sumérjase en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y el sangrado con bastoncillos de algodón. Evitar lesiones corry a la arteria basilar, hacer un corte de aproximadamente 1,5 mm de ancho que abarca el ancho de la pirámide y 0,5 mm de profundidad con Vannas Spring Tijeras perpendicular a la arteria basilar (Figura 2) para interrumpir las fibras de CST. NOTA: Marque los microtijeras antemano a 0,5 mm de la punta. Una vez que se abre la duramadre de la arteria basilar se puede mover ligeramente hacia un lado que permite un mejor acceso a la pirámide. Repetir el corte con la punta de una aguja de calibre 26 para asegurar la lesión incluye las fibras cerca de la arteria basilar. Detenga el sangrado con una ligera presión aplicada por bastoncillos de algodón. Opcionalmente, el corte puede ser cubierto con espuma de gel. Retire los retractores, reemplazar los tejidos y sutura sólo la piel con suturas de Vicryl 3-0. Después de la cirugía, mantener al animal en una incubadora a 32 ° C hasta que esté completamente despierto y administrar 5 ml de solución salina por vía subcutánea, si es necesario. No dejar al animal sin vigilancia. Dé Carporfen subcutáneacomo antiinflamatorio y como analgésico para el dolor post-quirúrgico uno después de la cirugía día. Supervise de cerca los animales durante una semana después de la cirugía y por lo menos una vez a la semana a partir de entonces. Como es requerido después de la cirugía, paquetes de gel de hidratación lugar, la comida de puré, puré húmedo y pienso seco en suelo de la jaula. Proporcionar botellas de agua con chorros largos (que carecen de válvulas, cojinete de bolas).

Representative Results

Las tasas de supervivencia. En un estudio representativo realizado por nosotros teníamos una tasa de supervivencia de 16 de las 20 ratas encapuchadas Lister femeninas (de 200 a 250 g). La complicación más común es la respiración dificultades por el desplazamiento tráquea o daños a los centros respiratorios en el tronco cerebral sólo dorsal a las pirámides (solitarii núcleo, ambiguas y parabrachilis). Resultados similares se han reportado en la literatura 16. Resultados conductuales. Una gama de pruebas de comportamiento se han utilizado para evaluar el resultado sensoriomotor después de pyramidotomy en roedores: la prueba de escalera horizontal, la sola pastilla alcanzar prueba, la prueba de la cría de cilindro y ensayo de la escalera Montoya son las evaluaciones de comportamiento más comúnmente utilizados. Otros ensayos descritos en la literatura son el sedimento alcanzar prueba, prueba cuerda de escalada, análisis de la marcha y la prueba de cinta adhesiva3,17-19. La mayoría de ellas muestran una funcional déficit motor 1 semana después de la lesión. En la actualidad, la mayoría de los estudios descritos en la literatura sólo realizan las pruebas de comportamiento hasta 42 días 4,11,13,20,21, o durante el tiempo más corto 3,18,22. Hemos realizado pruebas de comportamiento durante un período prolongado de tiempo y hemos visto la recuperación esencialmente completa de la función motora 8 semanas después pyramidotomy para algunas de las pruebas de comportamiento, excepto el ensayo de la escalera Montoya y la prueba de escalera horizontal. Esto es probablemente por varias razones. En primer lugar, el rostral CST lesionado a la lesión puede formar sinapsis en las neuronas en el tronco cerebral que actúan como relés indirectas a las neuronas motoras en la médula espinal. En segundo lugar, la no lesionada (contralateral) CST puede brotar y formas sinapsis en las neuronas en el tronco del encéfalo o de la médula espinal que actúan como relés a las neuronas motoras. En tercer lugar, otras vías motoras escatimado tales como los tractos reticulospinal, vestibuloespinales o rubrospinales pueden hacerse cargo de alguna función. Por lo tanto, un t duraderaratamiento efecto es difícil de detectar con muchas pruebas de comportamiento en el modelo pyramidotomy. Algunas pruebas de comportamiento en este modelo sin embargo podría indicar recuperación acelerada temprana después de la lesión, que se relaciona a un tratamiento. Prueba Cilindro Crianza 3,4,23 Con base en la prueba de cría cilindro CCT correspondiente a la pata delantera dominante resultó herido. Las ratas se colocan en un cilindro de plexiglás y el comportamiento de cría se observa durante un periodo de 3 min. Previo a la lesión se produjo una ligera preferencia por el uso de una pata delantera, la pata delantera dominante, durante la exploración vertical (Figura 3A). La lesión afecta el lado dominante y el uso de la pata delantera contralesional disminuyó a 28% en 1 Medidas semana después de la lesión (repetidas ANOVA p <0,05; análisis post-hoc revelaron animales tienen déficits significativos en la semana 1, 2 y 3, p <0,05, LSD de Fisher). 4 semanas después de la lesión de los animales se recuperaron de unad utiliza la extremidad anterior afectada por el 45% de las partes posteriores, y después de 6 semanas este fue del 57% (n = 16, media ± error estándar se muestra). Ratones mismo modo, Starkey et al. (4) se han evaluado mediante la prueba de cilindro para un máximo de 42 días después de pyramidotomy y reportaron una disminución significativa en el uso de la pata afectada durante todo el período de pruebas. Prueba Montoya Escalera 24 Las ratas requieren pre-entrenamiento para esta prueba para aclimatarse antes de la lesión. Para aumentar la motivación en los animales de la sesión de pruebas se limita a los alimentos 15 g de alimento por rata la noche anterior. Los alimentos privados ratas se colocan en la escalera de Montoya durante 15 min. En cada lado, hay una escalera de 7 pasos con pozos, que contienen cada uno 3 pellets. El número total de los pellets obtenidos en cada lado se registran. El número de gránulos recuperados con el / pata afectada contralesional disminuyó significativamente de 61% previo a la lesión a3% 3 días después de la lesión (Figura 3B). La posibilidad de recuperar gránulos todavía se veía afectada significativamente a las 4 semanas después de la lesión con un 20% de los pellets obtenidos. Las ratas muestran un déficit significativo hasta la semana 8 con sólo el 29% de los pellets comido en ese punto del tiempo (ANOVA medidas repetidas p <0.05, el análisis post hoc reveló animales tienen déficits significativos en el lado contralesional en todos semanas, p <0,05, Fisher LSD). La pata ipsilesional se ve afectada hasta 1 semana después de la lesión; sin embargo, esto se recupera en la segunda semana (Medidas repetidas ANOVA p <0.05, el análisis post hoc reveló animales tienen déficits significativos en el día 3 y la Semana 1 de la pata delantera ipsilesional, p <0,05, LSD de Fisher). Los déficits iniciales de la pata delantera ipsilesional podrían explicarse por la lesioning de la parte ipsilateral del tracto corticoespinal corriendo a través de la pirámide truncada, con la posterior brotación y la recuperación. HorizontalPrueba de escalera 25 Las ratas requieren pre-entrenamiento para esta prueba. Las ratas caminan tres veces durante un largo escalera 1 m con distancia entre peldaños irregulares. Los vídeos se analizan más adelante en cámara lenta y el número total de pie resbala y pierde para cada pata se cuantifica. El gráfico de la figura 3C representa el número total de accidentes y trozos de la parte afectada y menos afectado (pata pata trasera +) como porcentaje del número total de las medidas adoptadas. Las ratas tienen un aumento significativo del número de errores de 1 semana después de la lesión con un 10% o 11% en el lado afectado y el lado menos afectado respectivamente. Este déficit es persistente en el lado contralesional / afectado hasta la semana 8 con un 10% de los errores cometidos, sin embargo, se resuelve por el lado ipsilesional / menos afectado por 2 semanas (ANOVA medidas repetidas, análisis post hoc reveló animales tienen déficits significativos en todas las semanas el lado contralesional y déficits significativos en la semana 1 y 3 en la ipsilesionallado, p <0,05, LSD de Fisher). Pruebas electrofisiológicas En un terminal electrofisiológico puesta a punto el animal fue anestesiado por vía intraperitoneal con uretano. Durante todo el procedimiento, se mantuvo a 37 ° C ± 1 ° C. Su región del cuello ventral, sus patas delanteras y la región del pecho se afeitaron y desinfectados con matorrales yodo. Las pirámides fueron expuestas como se describe anteriormente y el nervio radial fue expuesto en la parte superior del brazo por un enfoque ventral incisión de la piel y el músculo pectoral mayor. El extremo distal del nervio radial se cortó y el nervio se colocó sobre dos conexión para electrodos de plata-alambre en un baño de aceite mineral. De cualquier pirámide fue estimulado con electrodos bipolares concéntricos a diferentes profundidades con 5 pulsos a 300 Hz y una amplitud creciente estimulación. Grabaciones siempre se hicieron desde el nervio radial del brazo de minusválidos (Figura 4). Anim ilesoals, tuvo una fuerte respuesta a las latencias entre 12 a 20 ms en el nervio radial cuando la pirámide contralateral fue estimulado (Figura 4B). Estimulación ipsilateral sólo da lugar a la activación de vez en cuando (Figura 4C). Los animales que han recibido previamente pyramidotomies, en el lado contralateral al brazo de grabación no muestran ninguna respuesta en el nervio radial cuando el tracto lesionado es estimulada por encima de la lesión (Figura 4B '). Sin embargo, la estimulación de las fibras de CST en las pirámides ipsilateral a la grabación de electrodos dio lugar a una activación más fuerte en el nervio radial en comparación con animales no lesionados a las 12 semanas después de la lesión (Figura 4C '). Resultados anatómicos. Los animales fueron sacrificados 10 semanas después de la cirugía de acuerdo a la Ley de 1986. Dos semanas antes de la Lista 1 de los Animales (Procedimientos Científicos), el CCT no lesionado fue rastreado con biotinadextrano amina (BDA) inyecciones en la corteza motora 26 ipsilateral al brazo minusválidos (Figura 1). Esto permite la cuantificación de las fibras no lesionadas, que cruzan la línea media y suministrar el contralesional la médula espinal (Figura 5C, D). Animales no lesionados sólo tienen unas pocas fibras que cruzan la línea media, mientras que esto aumenta en respuesta a una lesión. Secciones de la médula espinal cervical transversales se tiñeron con la proteína quinasa C (PKC) gamma para evaluar la proporción de denervación en el CCT lesionado (Figura 5E) 16. Alternativamente, la integridad de la lesión puede evaluarse mediante la inyección de BDA trazador en la corteza motora del lado ipsilesional de la lesión pyramidotomy. La ausencia de etiquetado en el contralateral dorsomedial CST y la ipsilateral ventromedial CST haya puesto de manifiesto la transección unilateral completa. <img alt="Figura 1" fo:conte nt-width = "src" "4in" = "/ files / ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" /> Figura 1: Esquema mostrando los tractos corticoespinal en la rata y axotomía unilateral de la CST en las pirámides Imagen superior:. Corticoespinal neuronas se originan en la capa 5 células piramidales corticales. Amina dextrano biotinilado (representado en verde) se inyecta en la corteza contralesional dos semanas antes del final del experimento. Imagen Secundaria: Las extensiones forman las pirámides en la superficie ventral de la médula y en la unión raquimedular la mayoría de los axones decusa. Pyramidotomy unilateral se realiza en la médula caudal (en rojo). Baje la imagen: La mayoría de los tractos corticoespinal descuidado en las partes dorsomedial y dorsolateral de la médula espinal. Una minoría se queda ipsilateralmente y corre ventromedially. 1843fig2highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 2: Vista ventral del cerebro de la rata. Las pirámides son distintivos porque son criados, convexidades paralelas (caja amarilla). Las fronteras de las pirámides se definen medialmente por la arteria basilar (BAS) más de la línea media y lateralmente en la base de la convexidad a medio camino entre la arteria y la arteria basilar paraolivary (pol) como se ve en (C). Craneotomía se realiza sobre la arteria basilar y laterales que se extienden a la arteria paraolivary (cuadro rojo en C). Una pirámide se corta perpendicularmente a la arteria basilar (línea roja en C, corte se muestra en la muestra en A y B). Las lesiones colocados demasiado caudal cerca de las arterias vertebrales (vert) será incompleto porque el CST comienza a decusados ​​y porque la arteria vertebral se encuentra fuera de la línea media. (C) Imagen adaptada de "El Sistema Nervioso Rata" de George Paxinos 27. NOTA: Esta figura muestra una lesión en el lado izquierdo de las imágenes: esto es plataforma del animalht vía piramidal, ya que está en posición supina. Tenga en cuenta sin embargo que el video muestra una lesión a la izquierda vía piramidal del animal. Figura 3:. Los resultados representativos para la prueba de cría cilindro, Montoya escalera pellet alcanzar prueba y prueba Escalera horizontal Hay un déficit motor detectado por todas las pruebas después de la lesión. Sin embargo, ningún déficit puede detectarse con la prueba de la cría de cilindro a las 4 semanas después de la lesión, mientras que los déficits sostenidos pueden detectarse con la prueba de escalera de Montoya y la prueba de escalera horizontal hasta 8 semanas después de la lesión (n = 16 por grupo, los medios y el error estándar son se muestra). El asterisco indica p <0,05 respecto al valor basal previo a la lesión (prueba LSD de Fisher). Por favor, haga clic enaquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4:. Electrofisiología evaluar el tracto corticoespinal antes y después de pyramidotomy (A) muestra la configuración para el experimento terminal. Estimulamos las pirámides con un tren de pulsos de 5 a varias profundidades rostral al sitio de lesioning y decusación. El tracto rojo es el tracto lesionadas. Registramos del nervio radial en el lado contralesional. (B) y (C) muestran ejemplos de grabaciones con la estimulación ipsilesional o estimulación contralesional antes o 12 semanas después pyramidotomy. Estimulaciones ipsilesional evocan múltiples potenciales de acción compuesto (picos en la traza) en el nervio radial antes de la lesión (B). Estos son abolidas por la lesión y la actividad no Return en las 12 semanas (B '). Estimulación contralesional evoca rara previo a la lesión potenciales de acción único compuesto (C). 12 semanas después de la actividad de la lesión se incrementa considerablemente (C '), posiblemente debido a los axones intactos que brotan a través de la línea media y de plástico cambios dentro de la médula espinal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5:. Evaluación anatómica después de pyramidotomy (A, B, C, D) se utilizó biotinilado amina dextrano para rastrear el tracto corticoespinal mediante la inyección en la corteza motora correspondiente a la CST no lesionado (véase verde en la Figura 1). El medial dorsal, los componentes medial ventral de la CST son claramente visibles (A, parte medial dorsal magnificado en B). (C) y (D) son ampliaciones de (A) de fibras que brotan a través de la línea media en la materia gris del lado denervado en respuesta a un tratamiento. Para evaluar la integridad de la lesión secciones transversales del nivel cervical 4 (12 semanas después de la lesión tisular) fueron cortadas y teñidas con anticuerpos contra PKC gamma (E). El CST en el lado izquierdo de la imagen está intacto y puede ser visto a través de la línea media abultamiento en el lado denervado, presumiblemente a causa de la desintegración estructural de la dorsal lesionada CST.

Discussion

Hemos descrito el modelo de lesión pyramidotomy. El tracto corticoespinal se corta a nivel del tronco encefálico. Desde un punto de vista técnico, esta cirugía requiere mucha cautela y precisión. El tronco cerebral se adapta a los centros respiratorios y cardiovasculares en los centros de múltiples núcleos tales como el núcleo ambiguo y solitarii incrustado en la formación reticular debajo de las pirámides. Si se hace el corte demasiado profundo, puede conducir a problemas respiratorios repentinos, que pueden ser fatales. Damos Dopram justo antes del corte para aumentar la actividad de respiración para evitar una repentina interrupción de la respiración. Si la respiración se detiene, vale la pena ventilar el animal para los siguientes cinco minutos con el oxígeno que pueda recuperarse. Además, cualquier daño a la arteria basilar absolutamente debe ser evitado. Las complicaciones durante los primeros días después de la lesión son: otra hemorragia en el tronco cerebral que afecta a las funciones vitales, pérdida de peso considerable, diffic respiración severosulties debido al desplazamiento tráquea y de orientación y equilibrio graves problemas del animal debido a una lesión extensa incluyendo las aceitunas justo laterales a las pirámides. Estas complicaciones pueden ser tratados como puntos finales y los animales pueden ser sacrificados en condiciones decentes. Vigilancia estrecha durante la primera semana después de la cirugía es esencial. La alimentación suplementaria se puede dar con el fin de contrarrestar la pérdida de peso. Inflamación de las vías respiratorias (respiración ronca) normalmente se resuelve dentro de uno o dos días. Generalmente, los animales más jóvenes son más fáciles de operar sobre como su cuello es menos profundo. Además, son más resistentes y tienen menos complicaciones respiratorias.

Se requiere un poco de práctica para lograr una lesión completa de la CST con una pyramidotomy. Del mismo modo, en dos estudios realizados por Steward et al. 16, que se dispuso a replicar un antiguo experimento de Benowitz et al. 28, inicialmente reportado altas tasas de mortalidad y que algunos de sus lesiones fueron incompletas. Comportamientodéficit también serán variables. Recomendamos que un nuevo cirujano realiza muchas cirugías práctica pyramidotomy antes de realizar cualquier experimento completo para probar una terapia candidato. Formas de prevenir lesiones incompletas están volviendo sobre el corte con una aguja hipodérmica asegurándose de que las fibras corticoespinal cerca de la arteria basilar se cortan como se describe en este protocolo. Otras opciones son para aspirar el lugar de la lesión con una pipeta de vidrio con punta de succión como se describe en Zhou et al. 2003 29. Un alambre de tungsteno bien también se puede utilizar para cortar el tracto 22. Una alternativa a pyramidotomy es cortar la dorsal cervical C3 CST unilateralmente y después de cortar con un enfoque ventral la parte ventral C2 ipsilesional de la CST 18. Sin embargo podría decirse, una lesión completa no es necesaria si el objetivo es el estudio de la germinación de la contralesional CCT; si la mayoría de la pirámide está lesionada y una respuesta de germinación desde el lado no lesionado se produce esto puede ser suficiente.

Un objetivo de la modelo de lesión pyramidotomy es para la ablación de un lado del tracto corticoespinal y utilizar terapias de inducción de neuroplasticidad para estimular la plasticidad y la germinación de las fibras no lesionadas intacta. Para probar terapias neuroprotectoras este modelo no es adecuado y se debe utilizar otros modelos de perjuicio, como contusiones. Resultados del pyramidotomies se evalúan más a menudo con las pruebas de comportamiento y anatomía. La prueba escalera horizontal, la prueba de cría cilindro y ensayo de la escalera Montoya son las evaluaciones de comportamiento más comúnmente utilizados. Otros ensayos descritos en la literatura son el sedimento alcanzar prueba, prueba cuerda de escalada, análisis de la marcha y la prueba de 3,17-19 cinta adhesiva. Sin embargo, los resultados de la prueba de comportamiento más a menudo sólo están controlados hasta un máximo de 42 días postlesion 3,4,11,17,18,20-22. A partir de las experiencias del pasado, los roedores se recuperan más función en momentos posteriores, sin ningún tipo de tratamiento. Hemos demostrado That la prueba de escalera horizontal y la prueba de llegar a Montoya escalera pellet detectan discapacidad hasta un punto de tiempo más tarde. Pueden ser utilizados para medir la recuperación funcional debido a un tratamiento. La integridad de la lesión se juzga por la tinción de PKC gamma (que las etiquetas de fibras CST en las columnas dorsales) de la médula espinal a nivel cervical rostral o eriocromo cianina tinción de las secciones transversales de la zona de la lesión. Amina dextrano biotinilado se puede inyectar en la corteza contralesional para evaluar el surgimiento de las fibras intactas a través de la línea media en el área de la médula espinal denervado.

En conclusión, el modelo pyramidotomy es bueno para la evaluación de las capacidades de neuroplasticidad inductores de un fármaco de tratamiento para las lesiones del sistema nervioso central si la cirugía se domina con éxito. Evalúa la plasticidad de las fibras intactas. El siguiente paso sería utilizar un modelo más clínicamente relevante, como contusiones para evaluar la capacidad del medicamento para superar injuri más grandeses que afecta a múltiples extensiones.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Internacional Spinal Research Trust y la rosales Fideicomiso.

Materials

Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 5mg/kg twice daily
Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
Isoflurane Abbott B506
Fine Scissors- Tough Cut Fine Science Tools 14058-09
Forceps Fine Science Tools 11019-12
Long-toothed Alm retractors Fine Science Tools 17009-07
cautery system kit Harvard Instruments 726067
fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
Carbon Steel burrs Fine Science Tools 19007-07
Dopram V-drops Pfizer apply 1 drop to tongue
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
gelfoam Equimedical EQU705001
3-0 Vicryl sutures Ethicon
operating microscope Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
Scales Ohaus NVT3201
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
25g needles Terumo NN-2525R
syringes (1ml and 5ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
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Referencias

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Kathe, C., Hutson, T. H., Chen, Q., Shine, H. D., McMahon, S. B., Moon, L. D. F. Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies. J. Vis. Exp. (94), e51843, doi:10.3791/51843 (2014).
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