A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
NG2 ifade eden hücreler (polydendrocytes oligodendrosit öncü hücreleri), merkezi sinir sisteminde, dördüncü bir glial hücre içerisinde yer alırlar. Embriyonik ve postnatal gelişim sırasında aktif çoğalırlar ve Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücreler sık primer ayrışmış kültürler, nöron cocultures okudu ve sabit dokuda edilmiştir. Kullanımı uygun yeni transgenik fare soyları kültür sistemleri ön beyin ve beyincik hem gri ve beyaz madde bölgelerde oligodendrosit soy hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması araştırmak için kullanılabilir dilim. Dilim kültürleri erken doğum sonrası farelerde hazırlanan ve 1 aya kadar kültür içinde tutulur. Bu dilimler hücresel davranış ve etkileşimleri araştırmak için kültür dönemi boyunca birden fazla kez görüntülenmiş olabilir. Bu yöntem NG2 hücre bölünmesi görselleştirme ve ayrıntılı analizini sağlarken olgodendrosit farklılaşma giden adımlar bölgede-bağlıdır veriyorent NG2 hücre ve olgodendrosit fonksiyonel heterojenite. Bu ise, in vivo olarak bulunan andıran bir hücresel ortamda zaman bu hücreleri etkileyen iç ve dış sinyalleri araştırmak için kullanılan bir güçlü bir tekniktir.
4 – merkezi sinir sistemi Organoytpic dilim kültürlerinin semiintact sistem 1 'de nöron ve glial hücre biyolojisi çalışmak için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. 9 – Bu kültürler, kabul ve bu hücre dışı ortamın bir manipülasyon ve tekrarlamalı uzun-süreli canlı hücre görüntüleme için kolay erişim ve elektrofizyolojik kayıtları 5, birincil hücre kültürleri ayrışmış birçok yararlarını korumak için nispeten basittir. Buna ek olarak, dilim kültürler, 3 boyutlu doku hücre mimarisini, bölgesel sinir bağlantısına sahip, ve en önemli hücre tiplerinin sistemde bulunmaktadır. Bu özellikler hücresel ve çevresel etkileşimleri ile tek hücre davranış ve fizyolojisini araştırmak için bu Kültürlerin benzersiz ve kullanışlı bir sistem yapmak.
NG2 hücrelerinin çoğalmasını ve m oluşturmaya devam memelilerin merkezi sinir sistemindeki glial hücreler bir nüfusembriyonik ve postnatal gelişim 10 sırasında oligodendrositleri yelinating. Bunlar yaygın olarak ayrışmış primer hücre kültürlerinde incelenmiştir ve floresan proteinleri NG2, hücre spesifik ifadesi ile transgenik fare hatları son gelişmeler, akut dilim preparasyonlarında in vivo kaderi haritalama ve elektrofizyolojik kayıtları kolaylaştırmıştır. Hatta bu çalışmalar ile, küçük NG2 hücre çoğalması ve olgodendrosit farklılaşmasının zamansal dinamikleri hakkında bilinmektedir. Ayrışık hücre kültürü geniş farmakolojik ve genetik manipülasyon göreli tesis için kullanılır, ancak, bunun hücresel mikro-bağlamını sağlamak tercih edilir, özellikle, beynin farklı bölgelerinde bu hücrelerin fonksiyonel farklılıklar sorgulamak için uygun değildir. Dilim kültürleri, hücre farmakolojik manipülasyonlar mükellef ve olgodendrosit myelinleşmeyi 11,12 araştırmak için kullanılır olmuştur basit bir alternatif sağlamak(LPC) lisolesitin veya antikor farmakolojik tedavinin 15 üzeri demiyelinizasyonu 13,14 ve remiyelinizasyon indüklenmesini sonra ular yanıt.
Bir yöntem araştırmak ve canlı görüntüleme ve sabit doku (veya Postfiksasyon) ön beyin ve beyincik hem de alınan organotipik dilim kültürlerde NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması olgodendrosit analizini tarif gerçekleştirmek için. Bu bölünme sonrası 16 tek NG2 hücrelerinin hücre kaderine incelemek için ve büyüme faktörü ile uyarılan NG2 hücre çoğalması 17 bölge ve yaşa bağlı farka için kullanılabilir güçlü bir yöntemdir. Bu, nispeten basit teknik ayrıca doğuştan ve / veya çevresel, bu glial hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite ya da mielin hasarına cevabı düzenleyen mekanizmaların hücre araştırılması yaygın erişilebilir.
Merkezi sinir sisteminde etkin Myelinasyon nöronal iletişim ve aksonal hayatta 22 için gereklidir. 25 – En beyin bölgelerinde 16,23 içinde yerleşik nüfusu korurken NG2 hücreleri sürekli yetişkinlik içine Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücrelerin farklılaşmasını düzenleyen bazı genetik ve moleküler mekanizmalar tarif edilmiştir ama çok keşfedilmeyi beklemektedir. Organotipik dilim kültürleri nedeniyle anatomik bölge, hücre dışı ortama kolay man…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Slice Culture Medium | |||
Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
Dissection Buffer | |||
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
Other Reagents and Supplies | |||
4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
Triton X-100 | 0.10% | ||
Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
Ethanol | |||
95% O2 5% CO2 gas mix | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
Sterile six well plates | |||
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
Manual or automatic tissue chopper | |||
Razor blades | |||
Disposable transfer pipettes | |||
35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
Stereomicroscope | |||
Inverted Phase Microscope | |||
Laminar Flow Hood | |||
Tissue Culture Incubator | |||
Inverted Fluorescence Microcope |