Musen tillbehör luktbulben (AOB) har varit svårt att studera i samband med sensorisk kodning. Här visar vi en dissektion som producerar en ex vivo preparat där AOB nervceller förblir funktionellt kopplade till deras perifera ingångar, underlätta forskning om behandling av mus feromoner och kairomoner information.
Musen tillbehörsLuktSinnet (AOS) är en specialiserad sensorisk väg för att upptäcka icke-flyktiga sociala lukter, feromoner och kairomoner. Den första neurala kretsen i AOS vägen, som kallas tillbehöret luktbulben (AOB), spelar en viktig roll för att skapa könstypiska beteenden såsom territoriell aggression och parning. Denna lilla (<1 mm 3) krets besitter förmågan att särskilja unika beteende stater, såsom kön, stam, och stress från chemosensory ledtrådar i sekret och utsöndringar av artfränder. Medan den kompakta organisation av detta system innebär unika möjligheter för inspelning från stora delar av kretsen samtidigt, utredning av sensorisk bearbetning i AOB är fortsatt utmanande, till stor del på grund av dess experimentellt ofördelaktig plats i hjärnan. Här visar vi en flerstegs dissektion som tar bort den intakta AOB i en enda halvklotet av främre musen skallen, lämnar anslutajoner till både de perifera vomeronasala sensoriska neuroner (VSNs) och lokala neuronala kretsar intakta. Förfarandet exponerar AOB yta till direkt visuell inspektion, underlätta elektrofysiologiska och optiska inspelningar från AOB-kretselement i frånvaro av anestetika. Vid insättning av en tunn kanyl i vomeronasala organet (VNO), som inrymmer de VSNs kan en direkt exponera periferin till sociala lukter och feromoner under inspelning nedströms aktivitet i AOB. Detta förfarande möjliggör kontrollerade undersökningar AOS informationsbehandling, som kan belysa mekanismer som kopplar feromon exponering för beteendeförändringar.
Sensorisk bearbetning i däggdjurshjärnan spänner typiskt multipla reciprokt-kopplade neuronala kretsar, vilka var och extraherar särdrag från sinnesintryck. I sensoriska banor, är tidig informationsbehandling avgörande för normal perception och beteende. I tillbehörs olfaktoriska systemet (AOS), är tillbehöret luktbulben (AOB) huvudmannen neural krets som förbinder den sensoriska periferin till strukturer nedströms som dikterar hormonbalansen 1,2, aggression 3, och upphetsning 4. Som sådan, är informationsbehandling inom denna krets starkt kopplade till förändringar i djurens beteende.
Tillbehöret luktbulben ligger i mus och råtta vid den dorsala / kaudala / bakre delen av huvud luktbulben (MOB) under den täta, vaskulariserad rhinal sinus. Den AOB emot afferenta innervation från axoner av perifer vomeronasala sensoriska neuron (VSNs) som bor i Vomeronasalorganet (VNO), en small blinda ändar rör i främre nosen strax ovanför mjuka gommen. Dessa axoner korsa känsliga ark septal vävnad vid den mediala gränsen för de nasala passager. Flera studier har sond AOB neurala reaktioner på källor till AOS lukter (t.ex. mus urin) in vivo med hjälp av sövda möss 5-7 eller fritt utforska djur 8. Den heroiska bedövas in vivo studier inblandade (a) tracheotomies att säkerställa djup anestesi och förhindra aspiration av vätska stimuli 5-7, (b) stimulering av det sympatiska livmoderhalscancer ganglion 6 eller direkt kanyle av Vomeronasalorganet 5,7 för att införa icke-flyktiga lukter och (c) craniotomies med eller utan pannloben ablationer att tillåta elektroden avancemang in i AOB 6. Awake / beter studier 8-10 involverade kirurgisk implantation av en Microdrive. Sammantaget dessa experimentella paradigm är kraftfulla, men ytterst svårt och ofta kräver narkos.
<p class = "jove_content"> Intressant, flera studier försökt upprätthålla sensoriska strukturer och nedströms nervbanor vid liv utanför kroppen (ex vivo) med viss framgång 11-15. Eftersom anslutningarna mellan VNO och AOB förblir ipsilaterala, och eftersom mittlinjen septal vävnad kan utsättas för syresatt superfusate i en enda halvklotet, försökte vi utveckla en sådan enkel-halvklotet ex vivo metod för att isolera dessa strukturer samtidigt som deras funktionella anslutningsmöjligheter. Vi lyckades nyligen i att uppnå detta mål 16. Detta preparat håller både VNO och AOB levande och funktionellt ansluten i minst 4-6 timmar eftersom båda axoner (längs mittlinjen mjuk septal vävnad) och AOB är relativt grunda <600 nm funktioner som är tillgängliga för superfuseras syre artificiell cerebrospinalvätska ( aCSF). Denna VNO-AOB ex vivo förberedelse möjliggör införande av kontrollerade stimuli till VNO via en tunn kanyl, ochdirekt visuell tillgång till den lilla AOB för riktade elektrodplacering och / eller levande fluorescensmikroskopi. Denna metod är fördelaktig om man önskar att studera dessa kretsar i frånvaro av anestetika. Eftersom detta tillvägagångssätt bryter centrifugal anslutningar, är det inte väl lämpade för undersökningar av centrifugal modulering av AOB funktion. VNO-AOB ex vivo förberedelser är svårt att lära sig, men en gång uppnått ger en pålitlig plattform för att undersöka kretsorganisation, informationsbehandling, och neural plasticitet i denna kraftfulla sensoriska krets.VNO-AOB ex vivo preparat beskrivs i detta protokoll är ett användbart alternativ till sövda in vivo 5-7 och akut lever segment 17 experiment av AOB-funktion. Till skillnad från akut AOB skiva experiment, som också exponerar kretselement för elektrofysiologiska och optiska inspelningar, behåller denna beredning alla sensoriska afferenter och intra-AOB anslutningar. Även om detta också kan sägas om bedövad in vivo-metoder, förekomsten av anestetika förändrar n…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) och Southwestern start medel (JPM).
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
#3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
#11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
Dissection Chamber | Custom | N/A | See Fig. 1 |
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
#5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
#5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
#5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
0.0045" Polyimide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
KCl | Sigma-Aldrich | various | |
CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
glucose | Sigma-Aldrich | various |