Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
Die axonalen Kompartiment von Neuronen zeigt ein hohes Maß an funktionaler Unabhängigkeit von der somato-dendritischen Fach. In Projektionsneuronen, enthalten die meisten Axone der neuronalen Protein 1,2. Das Studium der Physiologie und Pathophysiologie von Axonen hat Schwung in den Neurowissenschaften gewonnen, weil neuere Studien haben gezeigt, dass die frühe axonalen Dysfunktion scheint ein gemeinsames Merkmal der neurodegenerativen Erkrankungen und neuropsychiatrischen Störungen 3 sein. Es scheint wahrscheinlich, dass ein besseres Verständnis der axonalen-exklusive Mechanismen unter normalen und pathologischen Bedingungen wird Licht auf die frühen Ereignisse, die Dysfunktion fahren zu vergießen.
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie Kultureinsätze verwenden, die mit einem porösen Membran (Filter), um große Mengen von reinem axonalen Material, das geeignet ist für die biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Der Einsatz von Filtereinsätze zu studieren axonalen Biologie wurde zuerst von Steward umgesetzt undKollegen 4 und weiter durch Twiss und Kollegen fünf seiner derzeitigen Konfiguration entwickelt. Die Technik ist jetzt in der aktuellen Nutzung durch Gruppen studieren verschiedene Aspekte der axonalen Dendriten und Biologie, mit leichten Modifikationen in jedem Fall für die Population von Neuronen untersucht zubringen, die durchgeführten Behandlungen und die Art der biochemischen Analysen 6-9. Das vorliegende Protokoll hat nicht die Absicht, alle Alternativen für eine solche Vielzahl von Anwendungen unterzubringen, sondern eine einfache Methode, die für die meisten Anwendungen geeignet ist. Insbesondere die hier beschriebenen Protokoll verwendet eine Dreifach-Beschichtung, die axonalen Ausbeute für biochemische Analysen maximiert und ist bestens geeignet, um in der Literatur beschrieben axonalen Degeneration-anderen Beschichtungen studieren produziert weniger Axone, zurückziehen und schneller degenerieren, wenn sie von Nahrungsfaktoren 9 beraubt.
Bei diesem Verfahren bleiben die neuronale Zellkörper oberhalb der Filter wh isoliertile Axone verlaufen durch die Poren und wachsen entlang der Bodenoberfläche. Reine Axone (ohne Glia und neuronale Zellkörper Verunreinigungen), die auf der unteren Oberfläche des Filter wachsen kann für biochemische Analysen gesammelt werden oder kann in situ fixiert und durch immunzytochemische Methoden 9 untersucht werden. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von embryonalen sensorischen Neuronen der dorsalen Wurzelganglien (DRG). Embryonale DRGs sind weit verbreitet, um Biologie zu studieren, weil axonalen Neuriten aus diesen Zellen eine schnelle und robuste Wachstum in vitro, wenn sie in den Nervenwachstumsfaktor (NGF) gehalten, und weil sie schnell unterziehen Degeneration, wenn dieses Faktors beraubt. Auch DRG-Neuronen fehlt Dendriten, so dass alle mit dieser Methode gesammelt Neuriten sind rein Axone.
Filtereinsätze stellen im Vergleich zu anderen Ansätzen verwendet, um Axone zu studieren einen großen Vorteil. Untersuchungen sich auf die Verwendung der Mikroskopie zu unterscheiden Prozesse in der Zelle Soma von den in a vorkommendenXON-Fluß einen begrenzten biochemische Information. Als weiteres Beispiel teilten Kultursysteme (zB Campenot Kammern 10 oder 11 Mikrofluidvorrichtungen) sind nützlich zur Bildgebung Ansätze und für eine unterschiedliche Behandlung von Zellkompartimenten, bieten aber nur geringe Mengen des axonalen Material, was die Verwendung dieser Techniken für biochemische Analysen, die erfordern, relativ große Probenmengen. Weitere, ihre Verwendung erfordert eine umfassende Ausbildung sowie spezielle Geräte, und sie zeitaufwendig sind. Ein weiterer Ansatz oft verwendet, um Axone aus Explantaten isolieren ist es, eine Explantation Zentrum (mit neuronalen Zellkörpern), bevor axonalen Probensammlung manuell entfernen. Dies kann zwar große Mengen von Axon-angereicherten Präparationen erzeugen können Axone in dieser Zubereitung in Glia umhüllt und schnell nacheinander Entfernen Körper 20 Explantat von 6 Vertiefungen (als Beispiel eines minimalen Experiment) ist zeitaufwendig und an der Grenze des Machbaren.
Im Gegensatz dazu ist die hier vorgestellte Methode liefert reichlich und rein axonalen Vorbereitungen, die dann von nahezu jedem biochemischen Technik, die häufig verwendet wird, um ganze-Zelllysaten analysieren, wie Western-Blot, Immunpräzipitation 6, Northern Blot-5-Massenspektrometrie 6, RNA-Reinigung analysiert werden können 7,12,13, unter anderem. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um (IF)-Techniken Immunfluoreszenz, wie es möglich ist, Axone wachsen in der unteren Seite des Filters weiter zu untersuchen, indem sie IF fixieren. Dieser Ansatz erleichtert die Analyse der axonalen spezifische Prozesse, da es keine Zellkörper in der letzten Vorbereitung. Dies ist ein bedeutender Vorteil, da eine hohe Immunfluoreszenzsignal vom Zellkörper oft untergräbt Prüfung und Analyse von einem schwächeren Signal von dünnen Strukturen wie Axone stammen.
Zwei Anwendungen der Methode zur Kultur axonalen Degeneration ar studierene beschrieben; ein Modell der Entwicklungs Beschneiden und Modell Verletzungs-induzierte Degeneration (gemeinhin als Waller-Degeneration bezeichnet). Die Modellierung der Entwicklungs Beschneiden basiert auf der Tatsache, daß sensorische Neuronen in vivo für limitierende Mengen an Ziel-abgeleitete NGF und diejenigen weil es nicht genug neurotrophen Unterstützung degenerierten 14 empfangen Wettbewerb basiert. Dieses Phänomen kann in embryonalen DRG-Kulturen durch Abziehen von NGF aus den Kulturmedien, die, wie es in vivo auslöst axonale Degeneration, gefolgt von Zellkörper Zerstörung nachgeahmt werden. Waller-Degeneration zu modellieren, wird die obere Seite des Filters mit den Zellkörpern abgeschabt. Die Axone, die auf der Unterseite des Filters werden physikalisch von den Zellkörpern getrennt und danach die schnelle und stereotype degenerativen Prozess wie Waller-Degeneration 15 bekannt ist, nach A. Waller genannt, der als erster das Phänomen berichtet, im Jahr 1850 16 ziehen gewachsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wichtige Parameter, die bei der Anpassung dieser Technik nehmen sind die neuronalen Population, die untersucht werden sollen, ist das Substrat, Porengröße des Filters und Fläche. Alle diese Parameter beeinflussen die Spezifität, die Qualität und Quantität der Neuriten Zubereitung erhalten, und müssen durch den Anwender betrachtet werden. In den in diesem Protokoll angegebenen Beispiele die Verwendung von DRG-Neuronen hat den Vorteil, der sich nur Axone, wodurch ein reines (spezifischen) axonalen Zubereitung.
…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
Referencias
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
