Phenotype के लिए उच्च throughput परख<em> साल्मोनेला enterica</em> Typhimurium एसोसिएशन, आक्रमण, और मैक्रोफेज में प्रतिकृति
Summary
इन विट्रो फेनोटाइप साल्मोनेला या अन्य बैक्टीरियल एसोसिएशन, आक्रमण, और उच्च throughput क्षमता के साथ phagocytic कोशिकाओं में नकल करने के लिए एक उच्च throughput परख विकसित किया गया था. विधि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में उनके involvements के लिए साल्मोनेला जीन पीटा उत्परिवर्ती उपभेदों का मूल्यांकन करने के लिए नियुक्त किया गया था.
Abstract
साल्मोनेला प्रजातियों जूनोटिक रोगजनकों और मनुष्यों और पशुओं 1 में खाद्य जनित बीमारियों का प्रमुख कारण होते हैं. साल्मोनेला -host बातचीत अंतर्निहित तंत्र को समझना साल्मोनेला के संक्रमण की आणविक रोगजनन स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. Gentamicin संरक्षण परख उच्च throughput स्क्रीनिंग रॉ 264.7 murine मैक्रोफेज का उपयोग कर मेजबान बातचीत में साल्मोनेला enterica सीरोटाइप Typhimurium का विलोपन म्यूटेंट की भूमिका को परिभाषित करने के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था phagocytic कोशिकाओं में साल्मोनेला एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति phenotype के लिए. इस प्रोटोकॉल के तहत विचरण जंगली प्रकार और कई उत्परिवर्ती उपभेदों एक ही संस्कृति डिश में और एक ही समय में परीक्षण किया जा सकता है क्योंकि माप में काफी मानक प्रोटोकॉल की तुलना में कम है. मल्टीचैनल pipettes का उपयोग बढ़ जाती है throughput और सटीक बढ़ाता है. इसके अलावा, चिंताओं कम हो का उपयोग करने के लिए संबंधित96 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में अच्छी तरह से प्रति सेंट कोशिकाओं को संबोधित कर रहे थे. इधर, phagocytic कोशिकाओं का उपयोग कर संशोधित इन विट्रो साल्मोनेला आक्रमण परख के प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एसोसिएशन, आक्रमण और intracellular नकल के लिए 38 व्यक्ति साल्मोनेला विलोपन म्यूटेंट phenotype के लिए नियुक्त किया गया था. इन विट्रो phenotypes, जिनमें से कुछ को बाद में एक पशु मॉडल में विवो phenotypes में है की पुष्टि की थी, प्रस्तुत कर रहे हैं. इस प्रकार, संशोधित, मानकीकृत परख उच्च throughput क्षमता बैक्टीरियल मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए और अधिक मोटे तौर पर उपयोग किया जा सकता है साथ मैक्रोफेज में साल्मोनेला एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति phenotype के लिए.
Introduction
Nontyphoidal साल्मोनेला सभी रीढ़ में आंत्र रोग का महत्वपूर्ण कारण होते हैं. मानव में सलमोनेलोसिज़ शीर्ष जीवाणु खाद्य जनित रोगों 1 के बीच है. उनके पशु मेजबान के साथ साल्मोनेला की बातचीत पिन कि आणविक तंत्र की विशेषता मुख्य रूप से संक्रमण के ऊतक संस्कृति और पशु मॉडल में साल्मोनेला enterica सीरोटाइप Typhimurium (एसटीएम) के अध्ययन के माध्यम से हासिल की है. एसटीएम मेजबान बातचीत में अंतर्दृष्टि रहा हमें साल्मोनेला जीवित और मेजबान कोशिकाओं के अंदर हो जाना कैसे समझने में मदद मिलेगी. इन मुलाकातों का अध्ययन में पहली चुनौती मेजबान और रोगज़नक़ दोनों से संभव के रूप में कई भाग लेने वाले कारकों की पहचान करना है, लेकिन इन प्रयासों को बड़े पैमाने पर, एक साथ दो स्वतंत्र जटिल जैविक प्रणालियों के साथ यानी, मेजबान और साल्मोनेला निपटने के महत्वपूर्ण कठिनाइयों से बाधित कर रहे हैं, शारीरिक शर्तों के तहत. साथ ही, बड़े repertसाल्मोनेला की oire और संभावित मेजबान बातचीत में शामिल कारकों एन्कोडिंग मेजबान जीन इस चुनौती से निपटने के लिए उच्च throughput जैविक मंच की आवश्यकता होती है.
एक संशोधित, मानकीकृत परख संभावना साल्मोनेला -host बातचीत में उलझाने के जीनों का एक बड़ा सेट की जांच करने के लिए विकसित किया गया था उच्च throughput क्षमता के साथ मैक्रोफेज में साल्मोनेला एसोसिएशन, आक्रमण और प्रतिकृति phenotype के लिए. Gentamicin संरक्षण परख 1973 2 में विकसित किया गया था, लेकिन पहले अच्छी तरह से 1994 3,4 में Elsinghorst द्वारा वर्णित किया गया था. अब यह साल्मोनेला 5,6 सहित पूर्व vivo कई intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों, अध्ययन के लिए एक मानक उपकरण बन गया है. भली भाँति बैक्टीरिया कोशिकाओं 3 घुसना नहीं कर सकते हैं कि Gentamicin जैसे कुछ एंटीबायोटिक दवाओं,, द्वारा मारा जा रहा से बचने. इस घटना का लाभ लेने से, Gentamicin संरक्षण परख intracellular बीए के अस्तित्व और विकास के उपायcterial रोगजनकों. संक्रमण के दौरान तीन घटनाओं, यानी, यूकेरियोटिक कोशिकाओं, आक्रमण और प्रतिकृति के साथ मिलकर, संक्रमण, Gentamicin उपचार, और आगे ऊष्मायन (चित्रा 1) के बीच समय अंतराल पर आधारित intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. यूकेरियोटिक सेल लाइनों मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए प्रासंगिक पशु मॉडलों की तुलना में कम जटिल है कि एक मनोवैज्ञानिक वातावरण प्रदान करते हैं.
Gentamicin संरक्षण परख एसटीएम मेजबान बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मंच है, लेकिन एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में मानक परख कम throughput क्षमता है. इन विवो डेटासेट के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण लगभग 300 मेजबान जीन उत्पादों (अप्रकाशित डेटा) के साथ बातचीत करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं कि 149 साल्मोनेला जीन उत्पादों की पहचान की. मानक Gentamicin संरक्षण परख कुशलता म्यूटेंट की इस संख्या phenotype करने की क्षमता नहीं है.
Addit मेंआयन, Gentamicin संरक्षण परख सैद्धांतिक रूप से एक भी जीवाणु के आक्रमण का पता लगा सकते. अलग अलग समय पर दोहराया जब इस वजह निहित संवेदनशीलता की, कच्चे डेटा तकनीकी प्रसरण लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. आंतरिक नियंत्रण और सामान्य बनाने के बाद रिश्तेदार डेटा प्रस्तुति परिणामों की सार्थक व्याख्या के लिए आवश्यक हैं. इन बातों को देखते हुए एक संशोधित, मानकीकृत Gentamicin संरक्षण परख परीक्षण क्षमता बढ़ाने के लिए और परिशुद्धता बढ़ाने के लिए विकसित किया गया था.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल विस्तृत और 96 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन और murine बृहतभक्षककोशिका RAW264.7 सेल लाइन का उपयोग कर संशोधित Gentamicin संरक्षण परख प्रदर्शन करने के लिए सचित्र है. 24 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में मानक प्रोटोकॉल की तुलना में, संशोधित प्रोटोकॉल निम्न फायदे हैं: 1) 96 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन का प्रयोग पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के साथ आंतरिक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित phenotyped होने के लिए 10 अलग अलग उत्परिवर्ती उपभेदों अप करने के लिए अनुमति देता है;उत्परिवर्ती उपभेदों एक ही संस्कृति डिश में और एक ही समय में परीक्षण कर रहे हैं क्योंकि 2) के परिणाम के विचरण काफी कम हो जाता है; ऑपरेटर थकान को कम करते हुए 3) मल्टीचैनल pipettes का उपयोग throughput बढ़ जाती है. अन्त में, 24 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन की तुलना में, 96 अच्छी तरह से संस्कृति डिश में अच्छी तरह से प्रति कम मेजबान कोशिकाओं की चिंताओं प्रोटोकॉल अनुकूलन और मानकीकरण के माध्यम से संबोधित कर रहे थे.
संक्षेप में, phagocytic कोशिकाओं में इन विट्रो फेनोटाइप साल्मोनेला या अन्य बैक्टीरियल एसोसिएशन, आक्रमण और नकल करने के लिए संशोधित, मानकीकृत परख प्रेसिजन बढ़ जाती है और ऑपरेटर थकान को कम करते हुए उच्च throughput क्षमता को प्राप्त होता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gentamicin संरक्षण परख व्यापक रूप से मेजबान सेल के अंदर intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के आक्रमण और प्रतिकृति अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह विशेष रूप से जिसका आक्रमण संक्रमण 1 स्थापित करने के…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह परियोजना (ए जे बी और एलजीए, R01 AI076246 के लिए) स्वास्थ्य NIAID के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए एक अनुदान द्वारा आंशिक रूप से समर्थन किया था. साल्मोनेला उत्परिवर्ती संग्रह आंशिक राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों (एम एम के लिए, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 और R01 AI075093-01) पड़ना, R21 के लिए आंशिक रूप से स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा, (द्वारा समर्थित किया गया AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). हम प्रतिकृति चढ़ाना और संग्रह में म्यूटेंट की पुष्टि के लिए स्टीफन Prowollik धन्यवाद.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
Referencias
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
