Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie

De huid is een van de grootste organen in het lichaam, met belangrijke functies in somato-sensatie, isolatie / thermoregulatie, en immuunsysteem ^1. Het begrijpen van de moleculaire en cellulaire basis van de ontwikkeling en functie van de huid is geweest van langdurige interesse vanwege het fundamentele belang van de huid als een biologisch systeem en de relevantie ervan voor dermatologie. Zoogdierhuid bevat een verscheidenheid aan meercellige structuren, met inbegrip gelaagde lagen van keratinocyten, dermale bindweefsel, verschillende soorten van haarzakjes, talgklieren, haarspier spieren, bloedvaten, en minstens een dozijn verschillende klassen van afferente (sensorische) en efferente zenuw vezels (figuur 1). Verschillende gebieden van het lichaam geassocieerd met typisch verschillende huidtypes. In de meeste zoogdieren, is vrijwel het gehele lichaamsoppervlak bedekt met huid die dicht zit vol met haarfollikels. [Mensen en naakte mol ratten vormen uitzonderingen op eis patroon.] Haar ontbreekt in de palmaire oppervlak van de handen en voeten, die ook worden geassocieerd met gespecialiseerde epidermale patronen (dermatoglyphs), exocriene klieren, en sensorische zenuwuiteinden. De cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die de groei, differentiatie en ruimtelijke rangschikking van cellen in de haarfollikel regelen van bijzonder belang aangezien elke follikel vertoont, in het klein, veel essentiële kenmerken van organogenese ^2. Deze functies omvatten het bestaan ​​van stamcellen en een stamcel niche, nauwkeurig gechoreografeerde cel migraties, en de assemblage van meercellige structuren uit embryologically verschillende componenten.

Dit artikel beschrijft methoden voor het ontleden, het bevestigen, etikettering, en imaging muis huid als een intacte twee-dimensionale vel, aangeduid als een "geheel mount" of "flat mount 'voorbereiding. Aangezien muis huid is relatief dun, is het mogelijk om beeld door de volledige dikte van afgeplatte skin met conventionele confocale microscopie. De flat mount aanpak zoogdierhuid beeldvorming is technisch voordelig omdat het omzeilt de noodzaak van fysieke snijden, waardoor structuren volledig te worden gereconstrueerd door optische sectie. Aangezien bijna de gehele huid wordt behandeld als een object, het vlakke zet benadering vergemakkelijkt ook de beeldvorming van meerdere gebieden van het lichaamsoppervlak met behoud van informatie over de positie en oriëntatie ten opzichte van het lichaam assen. Tenslotte structuren binnen de huid zijn typisch in patronen die regelmatig herhaald, waardoor de verzameling afbeeldingen vergemakkelijken van meerdere vertegenwoordigers van een bepaalde structuur. Deze kenmerken zijn bekend neurobiologists die via de retina, een tweedimensionaal gedeelte van het centrale zenuwstelsel die soortgelijke voordelen heeft voor onderzoek naar neuronale morfologie ³ werken.

De vlakke montage aanpak hier beschreven is van bijzondere utility voor het bestuderen structuren die ruimtelijke organisatie vertonen op grotere schaal in het tweedimensionale vlak van de huid. Een voorbeeld van grootschalige ruimtelijke organisatie is de gecoördineerde polariteit van de haarzakjes en haren-follikel geassocieerd structuren – Merkel cel clusters, haarspier spieren, talgklieren en zenuwuiteinden ^4. Haarzakjes georiënteerd onder een hoek ten opzichte van het vlak van de huid, en de component van de follikel vector die in de 2-dimensionale vlak van de huid ligt meestal vertoont een oriëntatie ten opzichte van het lichaam assen die nauwkeurig bepaald voor elk positie op het lichaam. Bijvoorbeeld, haarzakjes op de rug punt van rostraal caudaal en haren op het dorsale oppervlak van de voeten wijzen van proximale naar het distale. Haarfollikel oriëntatie wordt gecontroleerd door vlakke celpolariteit signalering (PCP, ook wel weefsel polariteit ^5). Dit signaleringssysteem werd ontdekt in Drosophila waar een kleineset van kern PCP genen werd gevonden om de oriëntatie van cuticulair haren en haren te controleren. Drie zoogdieren orthologa van kern PCP genen – frizzled homoloog 6 (Fzd6, ook wel aangeduid als Fz6), cadherine EGF LAG uit zeven cycli G-receptor type 1 (Celsr1), en vang-achtige 2 (Vangl2) – spelen analoge rollen in zoogdiercellen huid, het coördineren van de oriëntaties van de haarzakjes met het lichaam assen. Studies Fz6 knockout muizen (Fzd6 ^tm1Nat, hierna Fz6 ^{– / -)} blijkt dat de primaire defect bij afwezigheid van PCP signalering een eerste randomisatie of desorganisatie van haarfollikel oriëntatie, zonder effect op de intrinsieke structuur van de follikels ^6-8. Een tweede niet-PCP systeem werkt later plaatselijke aanpassing van nabijgelegen follikels, wat leidt tot de productie van grootschalige haar patronen zoals spiralen en bosjes bevorderen.

Een tweede voorbeeld van grootschaligeruimtelijke organisatie in de huid is te zien in de morfologie van sensorische axon priëlen. Sensorische neuronen die de huid innerveren hebben hun cellichamen in de dorsale wortel en trigeminus ganglia. Deze neuronen detecteren temperatuur, pijn, jeuk en diverse soorten mechanische vervormingen botst op de huid en haren ^9. Ze kunnen worden ingedeeld in subtypes gebaseerd op axon diameter en geleidingssnelheid, eindstandige zenuwuiteinde structuur en de patronen van expressie van receptoren, kanalen en andere moleculen. Vanwege de hoge dichtheid van innervatie in de huid, analyses die gepaard visualiseren alle axonen (bijvoorbeeld anti-neurofilament immunokleuring) of zelfs alle axonen van een klasse (wanneer men een enkel celtype wordt gekenmerkt door expressie van een fluorescerende reporter) onthult algemeen een dichte opeenstapeling van axonen die het onmogelijk maakt om de morfologie van een individuele as definiëren. Om dit probleem te omzeilen, hebben we gebruik uiterst schaars genetisch gerichte lAbeling naar dorsale huid monsters waarin afzonderlijke goed geïsoleerde axon priëlen worden gevisualiseerd door de expressie van een histochemische verslaggever, menselijke placenta alkalische fosfatase ¹⁰ te produceren. Deze aanpak maakt het eenduidige visualisatie van individuele axon prieel morfologie en een definitie van de soorten somatosensorische neuron op basis van morfologische criteria.