Real-Time Impedans Baserade Cell Analyzer som verktyg att avgränsa Molecular involverade i neurotoxicitet och Neuroprotektion i en neuronal cellinje
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Många hjärnrelaterade sjukdomar har neuronal celldöd medverka i patofysiologi. Förbättrad in vitro-modeller för att studera nervskyddande eller neurotoxiska effekter av läkemedel och nedströmsvägar involverade skulle hjälpa få insikt i de molekylära mekanismerna bakom neuro / neurotoxicitet och skulle kunna underlätta läkemedelsutveckling. Men många befintliga analyser toxicitet in vitro har stora begränsningar – de flesta bedöma neurotoxicitet och neuroprotektion vid en enda tidpunkt, inte gör det möjligt att observera tidsförloppet och kinetik effekten. Vidare skulle möjligheten att samla in information om nedströms signalvägar som är involverade i neuroskydd i realtid vara av stor betydelse. I det nuvarande protokollet beskriver vi användning av ett realtids impedans baserade cell analysator för att bestämma nervskyddande effekter av serotonin 2A (5-HT 2A) receptoragonister i en neuronal cellinje enligt etikettfria och realtids conditjoner med hjälp av impedans mätningar. Dessutom visar vi att inhibitorer av second messenger banor kan användas för att beskriva molekyler nedströms involverade i neuroskyddande effekt. Vi beskriver också användbarheten av denna teknik för att bestämma om en effekt på cellproliferation bidrar till en observerad neuroprotektiv effekt. Systemet utnyttjar speciella mikroplattor kallade E-Plattor som innehåller alternerande guld mikroelektroduppsättningar på undersidan av brunnarna, som används som cellsensorer. Impedansen avläsning modifieras genom att antalet vidhäftande celler, cellviabilitet, morfologi och vidhäftning. En dimensions parameter som kallas Cell Indexet härrör från de elektriska mätningarna impedans och används för att representera cellstatus. Sammantaget ger realtids impedans-baserade cell analysator för realtid, etikett-fri bedömning av neuroprotektion och neurotoxicitet, och utvärdering av andra budbärare vägar engagemang, bidrar till merdetaljerad och hög genomströmning bedömning av potentiella nervskyddande föreningar in vitro, för val av terapeutiska kandidater.
Introduction
Neuronal celldöd spelar en avgörande roll i patofysiologin för många hjärnrelaterade sjukdomar 1. Tillgången på tillförlitlig och hög genomströmning in vitro toxicitetsanalyser är avgörande för att få bättre insikt i de mekanismer för neurotoxicitet och att hjälpa till att välja nervskyddande molekyler som terapeutiska kandidater i läkemedelsutveckling 2. Men det finns många begränsningar för att mest använda in vitro neuro assays.They bedöma neurotoxicitet / neuroprotektion vid en enda tidspunkten inte tillåta kinetisk upplösning; ofta använder etikett eller sond som kan störa signalvägar och begränsa ytterligare studier i samma cell population, och är ofta arbetskrävande, och i många fall inte ger mekanistiska insikter. I föreliggande studie visar vi användbarheten av ett realtids impedans-baserade cell analysator för att bestämma neurotoxicitet och neuroprotektion i en neuronal cellinje i realtid och under etikett-friförhållanden och att ge insikt i mekanismerna nedströms genom analys av andra budbärare involverade i effekten.
Tidigare studier har bekräftat giltigheten av realtidscell analysator för att fastställa cytotoxicitet och effekter på celltillväxt i cellinjer jämfört med standardtekniker 3,4,5,6. Till exempel var en god korrelation observerats mellan avläsning av standard cellviabiliteten WST-1-analysen och Cell Index värden vid flera tidpunkter under basala spridande förhållanden och efter två olika giftiga paradigm i HeLa-celler 3. I A549 och MDA-MB-231 celler spridning och cytotoxicitet provocerade med mikrotubuli stabiliserings paklitaxel visade mycket likartade värden när bedöms av Cell Index mätningar och standardmässigt används sulforodamin B (SRB) analys 4. I neuronal cellinje av odödliggjorda hippocampusneuroner HT-22 Cellindex mätningar har validerats för sin förmåga to detektera cellproliferation, glutamat cytotoxicitet och cytoprotektion mot den allmänt använda 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazolium-bromid (MTT)-analys 5. I samma studie MTT analysresultat och Cell Index mätningar korrelerade också väl mäta neuronala progenitorceller spridning, cytotoxicitet efter tillväxtfaktorer berövande och räddning av cytotoxicitet av den pan-caspase hämmare QVD 5. Cytotoxicitet induceras i NIH 3T3-celler från Vandetanib (vascular endothelial growth factor receptor och epidermal tillväxtfaktorreceptor-hämmare) visade liknande resultat som mäts med Cell Index värden eller upptag av neutralrött analys 6.
Vi har nyligen använt realtidscellanalyssystem för att bedöma neuroprotektiva effekterna av serotonin 2A (5-HT2A) receptoragonist (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine klorid (DOI) i en neuronal cellinje ( SK-N-SH-celler) och screenas för medverkan av second messenger vägar genom att övervaka effekten av deras kemiska inhibition på den observerade neuro 7. Intressant, har 5-HT2A-receptorn både hallucinogena och nonhallucinogenic agonister (som DOI och lisurid, respektive), som kan aktivera både gemensamma och skilda andra budbärare vägar 8.
Fördelarna med den presenterade tekniken är att den gör det möjligt att samla in information i realtid om cellöverlevnad under dagarna, för att beskriva andra messenger vägar involverade, för att bedöma eventuella bidrag spridningseffekterna till neuroprotektion, och för att välja en optimal tid för ytterligare slutpunkts studier på samma cellpopulation. Ett schematiskt diagram av arbetsflödet i det nuvarande protokollet presenteras i Figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuvarande protokollet visar nyttan av en realtidscell analysator för att kontinuerligt och under etikettfria förhållanden bedöma nervskyddande / neurotoxiska effekter av föreningar i neuronala cellinjer och få inblick i den andra budbärare involverade i effekten.
Även om realtidscell analysatorn verktyg för att studera cytotoxicitet och effekter av droger på celltillväxt är allmänt erkänt, har endast ett fåtal studier som använt den i neuronala relaterade celltyper. Vi ha…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
Referencias
- Cavallucci, V., D’Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
