Analyzer הנייד מבוססת עכבה בזמן אמת ככלי להתוות מסלולים מולקולריים מעורבים ברעילות העצבית וneuroprotection בקו תאים עצבי
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
יש להם הפרעות הקשורות למוח רבים מוות של תאים עצביים המעורב בפתופיזיולוגיה שלהם. השתפר בדגמי מבחנה ללמוד השפעות נוירו או רעילות של תרופות ומסלולים במורד הזרם המעורבים יעזרו לקבל תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים של neuroprotection / רעילות עצבית ועלולים להקל על פיתוח תרופה. עם זאת, יש לי מבחני קיימים רבים במבחנה רעילות מגבלות עיקריות – רוב להעריך רעילות עצבית וneuroprotection בנקודת זמן אחת, לא מאפשר לראות בזמן הקורס וקינטיקה של ההשפעה. יתר על כן, את ההזדמנות כדי לאסוף מידע על מסלולי איתות במורד הזרם מעורבים בneuroprotection בזמן אמת תהיה בעל חשיבות רבה. בפרוטוקול הנוכחי אנו מתארים את השימוש של מנתח תא עכבה מבוססת בזמן אמת כדי לקבוע את ההשפעות להחדיר 2A סרוטונין (2A 5-HT) אגוניסטים קולט בשורת תאים עצביים תחת קונדיט התווית חופשית וזמן אמתיונים באמצעות מדידות עכבה. יתר על כן, אנו מראים כי מעכבים של מסלולי שליח שני יכולים לשמש כדי להתוות מולקולות במורד הזרם מעורבות בהשפעת ההגנה העצבית. אנו גם מתארים את השירות של טכניקה זו כדי לקבוע אם השפעה על שגשוג תאים תורמת לאפקט הגנה עצבי שנצפה. המערכת מנצלת צלחות המיקרואלקטרוניקה מיוחדות המכונים E-צלחות שמכילים לסירוגין מערכי microelectrode זהב על המשטח התחתון של הבארות, המשמשים כחיישני תא. קריאת העכבה היא שונה על ידי מספר התאים חסיד, כדאיות תא, מורפולוגיה, וההידבקות. פרמטר ממדים הנקרא Cell המדד נגזר ממדידות העכבה חשמליות ומשמש כדי לייצג את מצב התא. בסך הכל, מנתח תא העכבה מבוססת בזמן אמת מאפשר בזמן אמת, הערכה ללא תווית של neuroprotection ורעילות עצבי, וההערכה של מעורבות מסלולי שליח שנייה, שתרם ליותרהערכה מפורטת ותפוקה גבוהה של תרכובות הגנה עצביות פוטנציאליות במבחנה, לבחירת מועמדים טיפוליים.
Introduction
מוות של תאים עצביים ממלא תפקיד קריטי בהפתופיזיולוגיה של הפרעות הקשורות למוח רבים 1. הזמינות של תפוקה גבוהה אמינה ובמבחני רעילות מבחנה היא קריטית כדי לקבל תובנות טובות יותר את המנגנונים של רעילות עצבית וכדי לעזור לבחור מולקולות הגנה עצביות כמועמדים טיפוליים בפיתוח תרופות 2. עם זאת, יש מגבלות רבות לשימוש נרחב ביותר בassays.They רעילות העצבית המבחנה להעריך רעילות עצבית / neuroprotection בנקודת זמן אחת שאינו מאפשר רזולוציה קינטית; לעתים קרובות להשתמש בתווית או בדיקה שיכולה להפריע למסלולי האיתות ולהגביל מחקרים נוספים באותה אוכלוסיית תא, ולעתים קרובות הן עתיר עבודה, ובמקרים רבים לא מספק תובנה מכניסטית. במחקר הנוכחי אנו להדגים את התועלת של מנתח תא עכבה מבוססת בזמן אמת כדי לקבוע רעילות עצבית וneuroprotection בשורת תאים עצבי בזמן אמת ותחת ללא תוויתתנאים ולספק תובנות לגבי מנגנונים במורד הזרם באמצעות ניתוח של מסלולי שליח שני המעורבים בהשפעה.
מחקרים קודמים אישרו את תוקפו של מנתח התא בזמן אמת כדי לקבוע רעיל, כמו גם השפעות על שגשוג תאים בשורות תאים בהשוואה ל3,4,5,6 טכניקות סטנדרטי. לדוגמא, מתאם טוב נצפה בין קריאות של assay כדאיות תא WST-1 הסטנדרטי וערכי אינדקס סלולריים במספר נקודות זמן בתנאי התפשטות בסיסיים ולאחר שתי פרדיגמות רעילות שונות בתאי הלה 3. בA549 והתפשטות תאי MDA-MB-231 ורעיל עורר עם פקליטקסל מייצב microtubule הראה ערכים דומים מאוד כאשר הוערך על ידי מדידות מדד התא וsulforhodamine B משמש standardly (SRB) assay 4. בשורת התאים העצבית של הנוירונים בהיפוקמפוס הנציחו מדידות מדד HT-22 ניידים אומתו לt היכולת שלהםo לזהות התפשטות תאים, cytotoxicity גלוטמט וcytoprotection נגד 3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) בשימוש נרחב assay 2,5-diphenyltetrazolium-רומיד (MTT) 5. באותו המחקר תוצאות assay MTT ומדידות מדד התא גם בקורלציה גם במדידת התפשטות עצבית ותאים, רעיל אחרי קיפוח גורמי גדילה והצלה של cytotoxicity ידי QVD המעכב פאן-caspase 5. Cytotoxicity המושרה בתאי NIH 3T3 ידי Vandetanib (הקולטן לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם ומעכבי הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס) הראה תוצאות דומות נמדדו בערכי מדד תא או assay ספיגה אדומה הניטרלי 6.
יש לנו בשימוש לאחרונה מערכת מנתח תא בזמן אמת כדי להעריך השפעות להחדיר 2A סרוטונין אגוניסט הקולטן (2A 5-HT) hydrochloride (±) -2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) בשורת תאים עצביים ( תאי SK-N-SH) והוקרנו למעורבות של הערוץnd מסלולי שליח באמצעות ניטור ההשפעה של העיכוב הכימי שלהם על neuroprotection נצפה 7. מעניין, יש קולטן 2A 5-HT אגוניסטים שתי הזיה וnonhallucinogenic (כמו DOI וlisuride, בהתאמה), שעשוי להפעיל את שניהם מסלולי שליח שני נפוצים ומובחנים 8.
היתרונות של הטכניקה שהוצגה הם שהיא מאפשרת לאסוף מידע בזמן אמת על הישרדות תא שבמהלך ימים, כדי להתוות מסלולים שני שליח מעורב, על מנת להעריך את תרומתה האפשרית של תופעות התפשטות לneuroprotection, וכדי לבחור זמן אופטימלי ללימודי נקודת סיום נוספים על אותה אוכלוסיית התאים. תרשים סכמטי של זרימת העבודה בפרוטוקול הנוכחי מוצג באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מציג את התועלת של מנתח תא בזמן אמת כדי להעריך באופן רציף ובתנאים ללא תווית השפעות נוירו / הרעילות של תרכובות בשורות תאים עצביות וכדי לקבל תובנה מסלולי השליח השני המעורבים בהשפעה.
למרות שהשירות של מנתח התא בזמן אמ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
Referencias
- Cavallucci, V., D’Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
