Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Viele Gehirn-bedingten Erkrankungen haben den Zelltod in ihrer Pathophysiologie beteiligt. In-vitro-Modellen verbessert, um neuroprotektive oder neurotoxischen Wirkungen von Drogen-und nachgelagerten Wegen beteiligt würde helfen, einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Neuroprotektion / Neurotoxizität und Wirkstoffentwicklung könnte potenziell zu erleichtern studieren. Allerdings haben viele der vorhandenen In-vitro-Toxizitätstests wesentliche Einschränkungen – die meisten Neurotoxizität und Neuroprotektion beurteilen an einem einzigen Zeitpunkt, ohne dass sich die Zeit-Verlauf und die Kinetik der Wirkung zu beobachten. Darüber hinaus würde die Möglichkeit, Informationen über nachgeschaltete Signalwege bei der Neuroprotektion in Echtzeit beteiligt sammeln von großer Bedeutung sein. In der aktuellen Protokoll beschreiben wir die Verwendung einer Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse neuroprotektive Effekte von Serotonin 2A (5-HT 2A)-Rezeptor-Agonisten in einer neuronalen Zelllinie unter markierungsfreie Echtzeit-Condit bestimmenIonen unter Verwendung von Impedanzmessungen. Weiterhin zeigen wir, dass Inhibitoren der Second-Messenger-Pfade können verwendet werden, um Moleküle der in der neuroprotektiven Wirkung beteiligt abzugrenzen. Wir beschreiben auch die Nützlichkeit dieser Technik zur Bestimmung, ob eine Wirkung auf die Zellproliferation trägt zu einer beobachteten neuroprotektive Wirkung. Das System nutzt spezielle mikroPlatten als E-Platten, die alternierend Gold enthalten Mikroelektrodenarrays an der Bodenfläche der Vertiefungen als Zell-Sensoren dienen bezeichnet. Die Impedanz wird durch Auslesen der Anzahl der anhaftenden Zellen, Zelllebensfähigkeit, Morphologie und Adhäsion modifiziert. Ein dimensionsloser Parameter genannt Zellenindex wird aus den elektrischen Impedanzmessungen abgeleitet und wird verwendet, um den Zellstatus repräsentieren. Insgesamt ermöglicht die Echtzeit-Impedanz-basierten Zell-Analysator für Echtzeit-, markierungsfreie Beurteilung der Neuroprotektion und Neurotoxizität, und die Bewertung der zweiten Messenger-Pfade Beteiligung, einen Beitrag zu mehrdetaillierte und hohem Durchsatz Beurteilung potenzieller neuroprotektive Verbindungen in vitro, zum Auswählen therapeutischen Kandidaten.
Introduction
Neuronale Zelltod spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von zahlreichen Gehirn 1-bedingten Erkrankungen. Die Verfügbarkeit von zuverlässigen und Hochdurchsatz in vitro Toxizitätstests ist entscheidend, um einen besseren Einblick in die Mechanismen der Neurotoxizität zu gewinnen und zu helfen, wählen Sie neuroprotektive Moleküle als therapeutische Kandidaten in der Medikamentenentwicklung 2. Allerdings gibt es viele Einschränkungen am häufigsten in vitro Neurotoxizität assays.They verwendet beurteilen Neurotoxizität / Neuroprotektion zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt nicht erlaubt kinetische Auflösung; oft Etikett oder Sonde, die mit den Signalwegen stören können und weitere Studien in der gleichen Zellpopulation zu begrenzen, und sind oft arbeitsintensiv, und in vielen Fällen nicht bieten Einblick in den Mechanismus. In der vorliegenden Studie zeigen wir, den Nutzen eines Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse zu Neurotoxizität und Neuroprotektion in einer neuronalen Zelllinie in Echtzeit und unter bestimmen markierungsfreieBedingungen und um einen Einblick in nachgeschalteten Mechanismen, durch Analyse der sekundären Botenwege in der Wirkung beteiligt ist.
Frühere Studien haben die Wirksamkeit der Echtzeit-Zellanalyse bestätigt Zytotoxizität sowie Effekte auf die Zellproliferation in Zelllinien im Vergleich zu Standardtechniken 3,4,5,6 bestimmen. Zum Beispiel wurde eine gute Korrelation zwischen den Ablesungen der Standardzelle Lebensfähigkeit WST-1-Assay und Zellindexwerte zu verschiedenen Zeitpunkten unter basalen Bedingungen und Proliferation nach zwei verschiedenen toxischen Paradigmen in HeLa-Zellen 3 beobachtet. A549 und MDA-MB-231-Zellen-Proliferation und Zytotoxizität der Mikrotubuli-Stabilisator Paclitaxel provoziert zeigten sehr ähnliche Werte, wenn sie von Zellenindex-Messungen bewertet und zur standard Sulforhodamin B (SRB) Test 4. In der neuronalen Zelllinie verewigt Neuronen im Hippocampus wurden HT-22 Zellindex-Messungen für ihre Fähigkeit t validierto detect Zellproliferation, Glutamat-Cytotoxizität und Zellschutz gegen die verbreiteten 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Assay 5. In der gleichen Studie die MTT-Test Ergebnisse und Zellindex-Messungen auch gut in der Messung der neuronalen Vorläuferzellen Proliferation, Zytotoxizität nach Wachstumsfaktoren Not und Rettung der Zytotoxizität von der Pan-Caspase-Inhibitor QVD 5 korreliert. Zytotoxizität in NIH 3T3-Zellen durch Vandetanib (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor und den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) induziert zeigte mit Zellenindex-Werte oder Neutralrot-Aufnahmetest gemessen 6 ähnliche Ergebnisse.
Wir haben vor kurzem verwendet das Echtzeit-Zellanalysesystems neuroprotektiven Wirkungen des Serotonin-2A beurteilen (5-HT 2A)-Rezeptor-Agonisten (±) -2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine Hydrochlorid (DOI) in einer neuronalen Zelllinie ( SK-N-SH-Zellen) und für die Einbeziehung seco gescreentnd messenger Wege durch Überwachen der Wirkung der chemischen Hemmung der beobachteten Neuroprotektion 7. Interessanterweise hat der 5-HT 2A-Rezeptor sowohl halluzinogene und nonhallucinogenic Agonisten (wie DOI und Lisurid, beziehungsweise), die sowohl gemeinsame als auch unterschiedliche Second-Messenger-Signalwege aktivieren kann 8.
Die Vorteile der vorgestellten Technik sind, dass sie es ermöglicht, Informationen in Echtzeit auf das Überleben der Zellen im Laufe der Tage zu sammeln, zu beschreiben zweiten Botenwegen beteiligt, um den möglichen Beitrag der Proliferation Effekte auf die Neuroprotektion zu bewerten und eine optimale Zeit wählen für zusätzliche Endpunktstudien auf der gleichen Zellpopulation. Eine schematische Darstellung des Arbeitsablaufs in der Protokoll ist in 1 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll stellt den Nutzen eines Echtzeit-Zellanalyse kontinuierlich und unter Label-freien Bedingungen bewerten die neuroprotektive / neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen in neuronalen Zelllinien und einen Einblick in die Second-Messenger-Signalwege in der Wirkung beteiligt zu gewinnen.
Obwohl Dienstprogramm des Echtzeit-Zellanalysegerät zur Zytotoxizität und Wirkungen von Arzneimitteln auf die Zellproliferation zu untersuchen ist allgemein bekannt, haben nur wenige Stu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
Referencias
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