Kapsel Serotypisierung<em> Streptococcus pneumoniae</em> Durch Latexagglutination
Summary
Latex-Agglutinations-Test ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Serotypisierung Streptococcus pneumoniae, und auch weit verbreitet in diagnostischen Mikrobiologie aufgebracht. Dieses Manuskript beschreibt die in-house Produktion von Latexagglutination Reagenzien, Qualitätskontrollverfahren und die Anwendung dieser Technik auf den Pneumokokken-Serotyp.
Abstract
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Kindern im Alter von unter fünf Jahren weltweit, vor allem in einem ressourcenarmen Umfeld 1,2. Pneumokokken-Erkrankungen reicht von lokalisierten Infektionen zu lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Lungenentzündung, Sepsis und Meningitis 1,2.
Mehr als 90 Serotypen von Pneumokokken wurden identifiziert, basierend auf Unterschieden in ihren Kapselpolysaccharid 3. Aktuelle Impfstoffe zielen auf den Kapsel-Polysaccharid und bieten Schutz vor den wichtigsten Serotypen invasive Erkrankungen verursachen 4. Serotypisierung Pneumokokken-Isolate ist wichtig für die Beurteilung der Auswirkungen der Impfung auf Wagen und Krankheit sowie die Bereitstellung umfassendere epidemiologische Informationen 5,6. Die aktuelle "Goldstandard"-Methode für Pneumokokken-Serotypisierung ist die Quellung Test, aber es ist zeitaufwendig und erfordert etwas Geschick, um perform 7. Latexagglutination ist eine Alternative Serotypisierung Verfahren von der Weltgesundheitsorganisation 7 empfohlen. Latexagglutination ist schnell und einfach durchzuführen, und wird weltweit in vielen Labors 8-11 eingesetzt. Wichtig ist, dass Latexagglutination vergleichbarer Genauigkeit auf die Quellung Test für Pneumokokken-Serotypisierung 10,12-14 gezeigt. Insgesamt ist diese Methode ideal für ressourcenarmen Umfeld sowie hohe Durchsatzlabors.
Latex-Agglutinations-Reagenzien ("Latex-Reagenzien ') durch die Befestigung der Antikörper an Latexteilchen 15 angelegt. In einer positiven Reaktion agglutinieren diese markierten Teilchen in Gegenwart eines spezifischen Antigens. Kommerziellen Latex-Reagenzien sind für eine begrenzte Anzahl von Serotypen zur Verfügung. Latex-Reagenzien können auch in-house mit kommerziell erhältlichen Antiseren 10 hergestellt werden. Gemische von Antisera ("Pools") sowie spezifische Antiseren gegen Pneumokokken-serogroups (zB Gruppe 19), einzelnen Serotypen (beispielsweise Serotyp 5) und an spezifische Antigene ("Faktoren", zB., Faktor 19c erkennen Serotyp 19A) zum weiteren Definieren Serotypen innerhalb der Gruppen sind 16.
Diese Handschrift beschreibt die Hauptschritte bei der Herstellung von Latexreagenzien mit passiven Befestigung von im Handel erhältlichen Antiseren gegen Latexpartikel. Die Qualitätskontrolle (QC) Aspekte dieses Verfahrens beschrieben, und ein Protokoll für die Verwendung von Latexreagenzien zur Serotypisierung Pneumokokken enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latexagglutination ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Pneumokokken-Serotyp. Handels Pneumokokken Latexagglutination Reagenzien sind verfügbar, aber sie derzeit nicht zu differenzieren alle bekannten Serotypen 10,12. Allerdings Latexagglutination Reagenzien können leicht in-house mit gekauft Antiseren gegen spezifische Antigene Pneumokokken-Kapsel angehoben hergestellt werden. In dem hier beschriebenen Verfahren werden Antikörper passiv an Latexteilchen gebunden, um einen Satz von Latex-Agglutinations-Reagenzien zu machen.
Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Latex-spezifische Antikörper an die Latexpartikel gebunden zu befestigen, um Antigene auf den Polysaccharid-Kapsel der Pneumokokken isolieren 18,19. Die Latex-Teilchen an die Antikörper gebunden erlauben die spezifische Antikörper-Antigen-Reaktion ohne Vergrößerung sichtbar gemacht werden.
Latexagglutination ist eine geeignete Methode für die Hochdurchsatzlabor eind auch für ressourcenarmen Umfeld. Hauptvorteile des Verfahrens sind Latex-Agglutination, dass keine Spezialausrüstung erforderlich ist, um den Test durchzuführen, wurden die Reagenzien eine Haltbarkeit von mindestens 2 Jahren bei 4 ° C 8 gespeichert, und daß es kostengünstig, einfach und schnell durchführen soll. Serotypisierung eine Pneumokokken-Isolat von Latex-Agglutination dauert etwa 10 min und bis zu vier Latexreagenzien können parallel auf einer Folie getestet werden. Außerdem, wenn die Häufigkeit der Serotypen für die entsprechende Einstellung epidemiologischen bekannten Tests können in Runden beginnend mit den Pools, die die meisten gemeinsamen Serotypen ähnlich der Quellung Test 17 durchgeführt werden. Dieser Ansatz minimiert die Anzahl von Tests erforderlich, um den Serotyp bestimmen. Das Verfahren ist auch sehr gut reproduzierbar zwischen verschiedenen Betreibern (Daten nicht gezeigt). Ein Nachteil der Latex-Agglutination Serotypisierung ist, dass die Herstellung der Reagenzien ist zeitaufwendig, wobei ca. 4 h; obwohl mehrere reagents leicht parallel hergestellt werden. Darüber hinaus sind einige Antigene über verschiedene Pneumokokken-Serotypen gemeinsamen, was in Kreuzreaktionen mit einigen Antiseren (zB Serotyp 29, 42 und Gruppe 35). Allerdings sind diese Kreuzreaktionen gut charakterisiert, wenn mit kommerziellen Antisera (die in der Regel präabsorbiert ist es, die problematischer kreuzreagierenden Antikörper zu entfernen) und zusätzliche Reaktions Tabellen werden durch den Hersteller, um zu unterscheiden, welche Serotyp vorhanden ist. Latex-Reagenzien können auch überqueren reagieren, wenn die Antikörper nicht richtig auf der Latexpartikel ausgerichtet; diese werden als QC Defekt erkannt. Nach unserer Erfahrung ist streng QC für den Erfolg dieser Methode, auch wenn im Handel erhältlichen Antiseren werden für die Produktion verwendet. QC dauert etwa 15 min pro Reagenz und beruht auf einem Satz von geeigneten QC-Isolate wie oben beschrieben.
Die hier beschriebene Methode führt zu Reagenzien, die eine positive Reaktion gut wi gebendünn die Testphase. Nach unserer Erfahrung sind False Positives in der Praxis selten (Daten nicht gezeigt). Gelegentlich falsch negative Reaktionen werden beobachtet; in der Regel handelt es sich dabei um bekannte Probleme mit einem bestimmten Antiserum (zB kann der Serogruppe 6 Isolate nicht mit Pool B-Antiserum reagieren) oder Down-Regulation der Expression durch die Kapsel-Isolat. Verwendung der Serotypisierung algrorithm des Herstellers ist auch wichtig, da in den meisten Fällen eine falsche positive oder negative Reaktion auf einen "blinden Ende" Ergebnis führen. In diesen Fällen und wenn die Reaktionen sind schwer zu interpretieren, empfehlen wir wiederholen-Prüfung und / oder Prüfung durch eine alternative Methode, wie die Quellung Reaktion.
Einige Fehlersuche wird gelegentlich benötigt, um zufrieden stellende Latex-Reagenzien zu machen. In dem hier beschriebenen Verfahren wird der Antikörper an Latexteilchen durch passive Adsorption 15,19 befestigt, so dass eine kritische Variable ist die Konzentration des Antikörpers verwendet, der bestimmt, wie gutdie Oberfläche der Latexpartikel bedeckt und die anschließende Ausrichtung der Antikörper aktiven Stellen 15,20. Folglich wird, wenn unzureichende oder überschüssige Antikörper an Latexteilchen gebunden, die Antikörper-Antigen-Reaktionen nicht optimal, und unbefriedigende Reagenzien hergestellt 15,20,21 werden. Als Antikörpertiter variieren zwischen verschiedenen Chargen von Antiseren, kann ein Standard-Set von Verdünnungen Reagenzien, die gut 8 durchführen nicht produzieren. Ein guter Ausgangspunkt ist, um eine Verdünnung von 1:40 von Antiserum zu verwenden, und wenn dies nicht erfolgreich ist, verdünnen das Antiserum weiter. Nach unserer Erfahrung in der Regel löst das Problem 8. In einer kleinen Anzahl von Fällen können Reagenzien schwache Agglutination, die nicht von Clearing der Suspension begleitet wird, wenn getestet mit Ziel isoliert zu zeigen. In diesen Fällen wird die Antiserum verdünnt nicht die Qualität des Reagens verbessern, aber zufriedenstellende Reagenzien üblicherweise durch Auslassen der Zentrifugation hergestellt und Waschschritte 8,22 </sup>.
Antikörper beschichtet Latexpartikel werden häufig in der diagnostischen Mikrobiologie zur Erkennung, Identifizierung oder Serotypisierung von vielen verschiedenen Mikroben 15,20 eingesetzt. Als solches kann das hier beschriebene Verfahren eignet sich zur Herstellung Latex-Reagenzien für andere Zwecke, vorausgesetzt, dass geeignete Antiseren und ausreichend QC-Verfahren übernommen.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
| Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
| Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
| Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
| Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
| 5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
| Glycine | Merck | 10119.05 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
| Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
| Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
| 60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
| Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| *alternative sources are available for most materials | |||
Referencias
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