Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons
Summary
Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.
Abstract
GABAergische remmende interneuronen spelen een centrale rol in neuronale circuits van de hersenen. Interneuronen omvatten een klein deel van de neuronale populatie (10-20%), maar vertonen een hoge mate van fysiologische, morfologische en neurochemische heterogeniteit, als gevolg van hun verschillende functies. Daarom is onderzoek naar interneuronen biedt belangrijke inzichten in de organisatie principes en de functie van neuronale circuits. Dit vereist echter een geïntegreerde fysiologische en neuroanatomisch benadering voor de selectie en identificatie van individuele types interneuron. Whole-cell patch-clamp opnamen van acute hersenen plakjes van transgene dieren, de uiting van fluorescerende eiwitten onder de initiatiefnemers van interneuron-specifieke markers, biedt een efficiënte methode te richten en elektrofysiologisch karakteriseren intrinsieke en synaptische eigenschappen van specifieke soorten interneuron. Gecombineerd met intracellulaire kleurstof etikettering, kan deze aanpak worden uitgebreid met post-hoc-morphological en immunocytochemische analyse, waardoor de systematische identificatie van de geregistreerde neuronen. Deze werkwijzen kunnen worden aangepast aan een breed scala van wetenschappelijke vragen betreffende functionele eigenschappen van diverse soorten corticale neuronen te passen.
Introduction
Hippocampale neuronale circuits zijn al lange tijd het onderwerp van intensief onderzoek, zowel met betrekking tot de anatomie en fysiologie, als gevolg van hun essentiële rol bij leren en geheugen en ruimtelijke navigatie in zowel mensen als knaagdieren. Ook de prominente, maar eenvoudige laminaire organisatie van de hippocampus maakt deze regio een geliefd onderwerp van onderzoeken naar structurele en functionele eigenschappen van de corticale netwerken.
Hippocampale circuits bestaan uit prikkelende OG cellen (> 80%) en een kleinere (10-20%), maar zeer divers cohort van remmende interneuronen 1-3. Interneuronen laat γ-aminoboterzuur (GABA) vanaf het axon terminals die optreedt bij hoge ionotrope GABA A-receptoren (GABA A ±) en langzame metabotrope GABA B-receptoren (GABA B Rs) 4. Deze remmende mechanismen compenseren excitatie en reguleren van de prikkelbaarheid voornaamste cellen, en dus deir timing en het patroon van de lozing. Echter, GABA model van interneuronen werkt niet alleen OG cellen, maar ook van de interneuronen zelf 5,6. Pre-en postsynaptische receptoren bemiddelen feedback regulatie en remmende onderlinge interacties tussen de verschillende soorten interneuron. Deze remmende mechanismen in interneuron netwerken worden verondersteld centraal in de opwekking en de vormgeving van de bevolking activiteitspatronen, met name oscillaties om bij verschillende frequenties 7.
Whole-cell patch-clamp opname is een bekende methode voor het onderzoek van de intrinsieke eigenschappen en synaptische interacties van neuronen. Vanwege de grote diversiteit van interneuronen, onderzoek remmende interneuronen vereist strikte identificatie van de opgenomen cellen. Zoals hippocampus types interneuron worden gekenmerkt door duidelijke morfologische kenmerken en neurochemische markerexpressie, gecombineerd anatomische en immunocytochemische eNALYSE kan een middel zijn om precieze interneuron identiteit 6,8,9 te bepalen.
In dit artikel beschrijven we een experimentele benadering waarin whole-cell patch-clamp opnamen van enkelvoudige neuronen of synaptisch-gekoppelde paren gecombineerd met intracellulaire labeling, gevolgd door post-hoc morfologische en immunocytochemische analyse, waardoor de karakterisering van langzame GABA B receptor gemedieerde remmende effecten in geïdentificeerd interneuronen. Als voorbeeld, richten we ons op een groot type interneuron, een deelverzameling van de zogenaamde "basket cellen" (BC), die de soma en proximale dendrieten van de postsynaptische targets innerveert en wordt gekenmerkt door een "snelle spiking" (FS) sproeipatroon, een axon dicht die het cellichaam laag en expressie van de calcium bindend eiwit parvalbumin (PV) 10,11. Deze interneuronen tonen grote remmende postsynaptische stromingen, alsmede prominente presynaptische modulatie van hun synaptische productie, in reactie op GABA B R activering 12. De combinatie van technieken die hier beschreven kan evengoed worden toegepast op intrinsieke of synaptische mechanismen in een verscheidenheid van andere types geïdentificeerde neuron onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een werkwijze die elektrofysiologische en neuroanatomisch technieken combineert functioneel karakteriseren morphologically- en neurochemisch geïdentificeerde neuronen in vitro; in het bijzonder de verschillende vormen van corticale remmende ins. Belangrijke aspecten van de procedure zijn: (1) pre-selectie van potentiële INs; (2) intracellulaire opname en neuron visualisatie; en tenslotte (3) morfologische en immunocytochemische analyse van opgenomen INs. Hoewel dit onderzoek is gericht PV-ins bijzonder …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Ina Wolter bedanken voor haar uitstekende technische bijstand. VGAT-Venus transgene ratten werden gegenereerd door Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi en Y. Kawaguchi in Nationaal Instituut voor Fysiologische Wetenschappen, Okazaki, Japan, met behulp pCS2-Venus die door Dr A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
Referencias
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neurociencias. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
