Влияние Мужской аксессуар железы Продукты на откладки яиц в брюхоногих моллюсков

1. Питомника Получить взрослых особей Lymnaea stagnalis (L.) из лабораторной культуры, как тот в VU университета. Поддерживайте с низким содержанием меди воды при 20 ° С, как в разведении (molluscarium) и экспериментальных танков, которые имеют постоянный обмен воды. Установите цикл свет / темнота в 12 часов: 12 час. Для разведения, кормления взрослых улиток пестицидов салат без ограничений, кормить молодых птенцов с TetraPhyll (корм для рыб) хлопья. Поддерживать улиток в отдельных цистернах в соответствии с их возрастом, начиная с кладок, которые заложены в сроки с 24 часами. После того, как улитки удаляются из рыборазводных аквариумах они не вернулись, чтобы избежать последствий остались лежать в несколько отличающихся условиях, а также для предотвращения pseudoreplication. 2. Вскрытие Изолировать улиток в течение 1 недели, и кормить их вволю, чтобы обеспечить тхат они имеют полный спермы и семенной жидкости магазинов. Подготовка Стерео микроскоп, рассечение тарелку с булавками, небольшие хирургические ножницы, грубые и тонкий пинцет, мл шприц 10, заполненный с MgCl 2 решения 50 мм, инъекционных игл (0,3 мм х 13 мм) и некоторые бумажные полотенца. Усыпить улитку путем введения MgCl 2 решение (как правило, 3 мл или больше для взрослых улиток с длиной раковины 31,6 ± 2,1 мм и сырой вес 2,89 ± 0,55 г). Проникнуть ногу с инъекционной иглой на ° углом 45 и ввести осторожно применяя давление непрерывно, пока улитка не расслабляет и остается продлен (в течение нескольких секунд). Снимите инъекционной иглы и проверить, является ли эвтаназии улитка (например, путем проверки щупальце вывод рефлекс отсутствует). Осторожно снимите оболочку после его кривизны с помощью грубых щипцов. На полпути, мягко отсоединить columellar мышцы от оболочки, очищая пинцетом. Аккуратно скрутить тон улитки из его оболочки, после направлении обертывани оболочки. Поместите улитку на вскрытии пластины и придавить заднюю часть стопы. Затем поместите булавку через голову и положить некоторую напряженность на улитку, чтобы облегчить рассечение. Локализация женский gonopore, которые в дальнейшем быть ориентиром для вскрытия. Используя хирургические ножницы и тонкий пинцет, сделать первый надрез, как раз под краем мантии и сократить к женской gonopore. Когда один из ножей ножниц "выталкивается под стенкой тела, немного приподнимите его, чтобы гарантировать, что только стенки тела, и ни один из внутренних органов, режется. Продолжить резки над gonopore к голове и вырезать по прямой. Локализация предстательной железы (задний) и семенные пузырьки (передние). Проанализируйте эти тщательно и держать их на льду. Используйте их, чтобы сделать тестовые растворы, содержащие семенной жидкости и / или сперму. Используйте физиологический Lymnaea салине (5,83 ммоль / л CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 ммоль / л MgCl 2 · 6H 2 O, 42,69 ммоль / л NaCl, 37,53 ммоль / л KCl) в качестве среды-носителя. Сбор семенную жидкость, которая присутствует в просвете железы, а также спермы из семенных пузырьков. Впоследствии приостановить как в физиологическом растворе в отдельных флаконах, осторожно выражая их содержание и удаление ткани органа с пинцетом. Держите на льду и использовать в тот же день. Позже, смешивать эти суспензий для создания различных решений по лечению. 3. Влагалищном впрыска Перед началом внутривлагалищного процедуру инъекции, подготовить кремния оболочки-формы (сделанный для приспособления кончик оболочки), 1 мм шприцы, 10-12 см кремния трубки диаметром 1 мм, притупляются инъекционных игл (0,3 мм х 13 мм ), грубые щипцы и той же 10 мл шприц наполнен мМ MgCl2 раствора 50 установлены с резким инъекционной иглой. Сбор спермы, необходимое для добавления в семенной жидкости (или отдельных семенной жидкости белков) в некоторых обработок; биологически значимым доза равна 1/3 предстательной железы и семенных пузырьков на инъекцию. ПРИМЕЧАНИЕ: в результатах разделе представительной (рис. 1) результаты эксперимента с тремя различными лечения показаны: Control (носитель среднего, т. е. физиологический), Ovipostatin (один из выявленных семенной жидкости белков) в покое и Ovipostatin сопровождается спермой. Кроме того, для оценки биологически соответствующую дозу у других видов, определить разницу в весе предстательной железы лиц, которые недавно сопряженных и отдельных лиц, которые остались сексуально-изоляции 16. Подготовка 1 мл шприцы для каждого из подготовленных испытуемых растворов. Заполните каждый шприц с одним решением и убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха внутри. Установите притупленную инъекционной иглы на каждом шприце. Для инъекций используют 1мм Диаметр силиконовая трубка длиной минимум 10 см. Аккуратно вставьте кремния трубку на инъекционной иглой, следя, чтобы не проколоть трубку и удалите воздух из трубки, осторожно применяя давление на шприц. Анестезировать улитку, следуя той же протокол, что и в пункте 2.3. На этот раз убедитесь, что не вводят более 2-3 мл 50 мМ MgCl 2. Положите улитку в раковине-формы, чтобы держать его в устойчивом положении. Расположить женского gonopore, который четко видны в виде белой точки на правой стороне передней животных, в правый щупальцу и мужского gonopore (это положение также применимо к другим видам пресноводных улиток). Убедитесь в том, чтобы иметь беспрепятственный доступ. Используйте пинцет, чтобы удерживать конец силиконовой трубки и аккуратно вставьте примерно 2-4 мм в силиконовой трубки в женский gonopore. Осторожно надавливайте на шприц и впрыснуть 0,03 мл исследуемого раствора. Подождите половину минЮт, чтобы давление в трубе, чтобы распространиться в женский тракта, прежде чем снимать трубку. Вернуться обработанной улитку его изоляции контейнера, где он может быть контролируемой, и дать ему возможность оправиться от седации в экспериментальной бака. 4. Биопроб На каждом улитку для идентификации и измерить его длину оболочки. Последнее является хорошим показателем размера, которая имеет отношение, когда количественной репродуктивного выход. Храните каждый улитку изолированы в мл контейнер 460, который перфорированной для обеспечения водообмена в опытном танке. Важно, чтобы поместить все контейнеры в правильной ориентации, при этом перфорации в направлении потока воды, чтобы обеспечить эффективный обмен воды. Во время биотестирования, кормить улиток регулярно со стандартизированным количеством салата. Используйте круглую, металл перфоратор сократить салат. В этом протоколе салата диски 19,6 см 2 используются, которая приблизительно равна а,смонтировать они максимально может съесть в один день. Сбор в яичную массу с помощью плоской стороной шпателя и скрести яичную массу от стенки контейнера. Используйте ложку сторону собрать яичную массу. ПРИМЕЧАНИЕ: Непрозрачные кладки, которые только что были заложены не могут быть использованы для сканирования (они становятся прозрачными в течение нескольких часов после укладки). Для вида модели в этом протоколе, Lymnaea stagnalis, проверьте кладок каждый день, так как они производят 2-3 яичных массы в неделю. Это может отличаться у других видов. Сканирование собранные яичные массы в цифровом виде, с использованием (ноутбук) компьютер, содержащий драйвер сканера, плоский сканер кровать, стандартный миллиметровая шкала, шпателя, передавая тарелки и стеклянные плитки. Место каждого яичную массу на передавших пластин и повторять, пока планшеты не полны. Впоследствии промокните кладки сухой на бумажном полотенце и передавать их на стеклянные плитки в том же порядке, что и на передающих пластин. Поверните каждую плитку с ног на голову (кладки будет прилипать к стеклянной плитки) и осторожно поместите его на планшет сканера, только под миллиметровой шкале. Нанесите немного давления, чтобы сгладить яичные массы, которая будет распространять яйца равномерно, чтобы они были видны все в том же фокальной плоскости. Установите плитки с стандартизированной количества ленты вокруг двух ребер, чтобы гарантировать, что все яйца сглажены одинаково. Настройте параметры сканирования. Важно настроить разрешение на максимуме, сделать предварительное сканирование, обрезать рабочую зону, а также настроить яркость и контрастность. Сканирование яичные массы. Место каждого яичную массу в своем собственном надписью стеклянный флакон 20 мл для дальнейшего развития и вылупления. Обновить воду в вылупления флаконы через день, чтобы держать его правильно кислородом. Сделайте это в соответствии с номерами птенцов и размер в следующем порядке: переливание / не слива (нет птенцов), переполненные (начало вылупления), и извлечение из воды с помощью пипетки (многие птенцов). <р = класса "jove_title"> 5. Измерение и подсчет яиц Установите свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений ImageJ (NIH, США) и против клеток плагин. Открыть ImageJ а также программы электронных таблиц для передачи данных в. Затем откройте отсканированный картину кладок в ImageJ. Установите масштаб при помощи функции масштабирования, чтобы перейти к миллиметровой шкале. Увеличение и настроить окно для 1 мм, чтобы заполнить весь экран. Нарисуйте линию с помощью инструмента линии между двумя линиями, которые указывают на 1 мм. Перейдите Анализ и указан масштаб. В всплывающем меню опцию измеренная длина становится видимым, отрегулируйте известном расстоянии в 1 и единица длины в мм. Установите флажок Global, и закройте окно. Установка предпочитаемых измерений (длина, ширина, толщина), перейдя в анализируйте и указан Измерения выбрав Площадь и диаметр Фере (длина и ширина). Нажмите кнопку ОК для подтверждения и перехода с изображением анализов. Для измерения яйца, зоом в яйце на первой яйцемассы, которая должна быть измерена. Зум 800% рекомендуется. Затем, используя эллиптические инструмент нарисуйте овал именно вокруг яиц, нажмите Ctrl + D, чтобы нарисовать окружность на изображении (для предотвращения измерения те же яйца дважды). Затем нажмите Ctrl + M, чтобы записать меру свойств овала (длина, ширина, толщина); экран всплывающее открывает отображения измерений. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование эллиптической инструмента для измерения яйца не относится ко всем видам. Для видов с неравномерно формы яиц, используйте от руки выборы вместо этого. Измерьте, как много яиц, как необходимые, а затем сохранить меры,. Листа XLS. По желанию, скопировать данные непосредственно в таблицу. Впоследствии рассчитывать яйца внутри массы яиц, с помощью окна счетчика и поставить счетчики вручную в таблицу. С другой стороны, рассчитывать индивидуальные яиц в кладке с помощью клеточной счетчика плагина. Для этого перейдите к плагинов,затем, анализировать и выберите счетчик Cell. Окно счетчик клеток появится, проверить ", имейте в исходное 'окно и нажмите' инициализации. Появится новое окно счетчика, выберите инструмент перекрестие на панели инструментов и выберите тип счетчика в меню счетчика клеток. Всего отдельные яйца, нажав на отдельных яиц в окне счетчика клеток. Соблюдайте общее число рядом с типом счетчика в меню счетчика клеток. Скопируйте этот номер вручную в электронную таблицу или получить результаты, нажав результаты. Всего несколько массы яичные рамках одного события подсчета, добавив типы счетчиков, если это необходимо.