주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에
Summary
주요 조직 적합성 복합체 클래스 II dextramers 직접 염색으로 뇌와 심장 자기 반응성 CD4 T 세포를 감지하는 프로토콜은이 보고서에 설명되어 있습니다. 종합적인 분석을 위해, 시츄 항원 특이 CD4 + T 세포의 빈도를 열거하는 신뢰할 수있는 방법도 고안되어있다.
Abstract
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Introduction
주요 조직 적합성 복합체의 사용은 항원 특이 CD4 T 세포의 검출 (MHC) 클래스 II 테트라 도전 1-7이었다. MHC 클래스 II 테트라의 검출 감도를 향상시키기 위해, 연구팀은 지정된 차세대 테트라, "dextramers"8을 만들었습니다. Dextramers는 여러 가지 펩타이드 닿는, 바이오틴 MHC 단량체 한 덱스 트란 분자 9에 부착 할 수있는 여러 스트렙 타비 딘 – 형광 부분이 접합되는 덱스 트란 등뼈가 포함되어 있습니다. 따라서, 몇개의 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 MHC dextramers의 큰 응집체가 다수의 T 세포 수용체 (TCR도)와 상호 작용할 수있다.
이 그룹은 최근 다양한 자기 항원에 대한 dextramers을 생성 dextramers의 검출 감도가 약 테트라 8보다 5 배 정도였다. 실험 시스템은 실험자가 면역 뇌척수염을 포함 (EAE) 테오 단백질 (PLP) SJL 마우스에서 139-151로 유도; EAE는 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) C57BL / 6 마우스에서 35-55로 유도; 실험자가 면역 심근염 (EAM)는 심장 미오신 중쇄-α (Myhc) A / J 생쥐에서 334-352로 유도. 이 연구는 PLP 139-151의 사용을 보여 – 및 Myhc 334-352함으로써 형광 항체를 사용하여 신호를 증폭 할 필요가 없어, 직접 염색 프로토콜을 개발함으로써 특이 반응계에서 항원 특이 CD4 T 세포를 검출 dextramers 접근 일반적으로 테트라의 사용과 채택했다. 또, 조직을 평가하는 포괄적 인 방법은 또한 안정적 시츄 (10) 항원 특이 CD4 T 세포의 빈도를 열거 고안되었다. 시츄 항원 특이 T 세포의 검출 와키 활성화로 인한 것과 특정 항원 자극에 의해 유발 사건 묘사를 허용한다. 마찬가지로,있는 현장 기술도 제공하기대상 기관에 항원 특이 T 세포 침윤의 동역학을 추적하는 에스 기회.
Protocol
Representative Results
Discussion
MHC 클래스 I 테트라와는 달리, 일상적인 응용 프로그램의 MHC 클래스 II 테트라의 사용은 특히 자신의 활성화 종속성 6,15-17에 부분적으로 인해 낮은 친화력자가 반응 CD4 T 세포의 전구체 주파수를 열거하는 도전되고 있습니다. 최근에,이 문제는 이러한 PLP 139-151, MOG 35-55과 Myhc 334으로자가 항원의 수를 항원 특이 CD4 T 세포를 감지하는 우리를 허용 ", dextramers"라고 사량의 다음 세대를 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 심장 협회와 어린이의 심장 근육 병증 재단 (SDG2462390204001)과 국립 보건원 (HL114669)에 의해 지원되었다. CM은 심근염 재단, NJ에 의해 수여 박사 학위 취득 후 연구 활동 보조금의 수상자이다.
Materials
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
Referencias
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