Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.
Sedan introduktionen i slutet av 19-talet, har Langendorff isolerade hjärta perfusion apparat, och den efterföljande utvecklingen av arbetshjärtmodellen varit ovärderliga verktyg för att studera kardiovaskulär funktion och sjukdom 1-15. Även Langendorff hjärt preparatet kan användas för alla däggdjur hjärta, de flesta studier med denna apparat använder små djurmodeller (t.ex. mus, råtta och kanin) på grund av den ökade komplexiteten i system för större däggdjur 1,3,11. En stor svårighet är att säkerställa en konstant koronarperfusionstrycket över en rad olika hjärt storlekar – en nyckelkomponent i något experiment som använder denna enhet 1,11. Genom att byta ut det klassiska hydrostatiska efterbelastningspelare med en centrifugalpump, Langendorff arbetar hjärta apparat som beskrivs nedan möjliggör enkel justering och stram reglering av infusionstryck, vilket innebär samma uppställning kan användas för olika arters eller hjärt storlekar. Dessutom kan denna konfiguration också sömlöst växla mellan konstant tryck eller konstant flöde under reperfusion, beroende på användarens preferenser. Den öppna karaktären av denna inställning, trots att temperaturreglering svårare än andra konstruktioner, möjliggör enkel samling av gråvatten och kammartryckvolymdata.
Mycket av vår förståelse av grundläggande hjärt biologi och fysiologi har kommit från experiment som utnyttjade den isolerade, retrograd-perfusion Langendorff hjärta och de isolerade arbetande hjärtsystem. Dessa experimentella system fortfarande i stor utsträckning används i dag för att utöka vår kardiovaskulära kunskap om viktiga ämnen, bland annat ischemi-reperfusion skada 2, konditionering 4, cellbaserad terapi för skadade hjärtmuskeln 5,7, hjärt effekter av läkemedel 6,9 och hjärt allograft bevarande tekniker 8,15-18.
Medan både isolerade hjärtsystem kan användas för alla däggdjursarter, är de främst användas på små däggdjur, såsom marsvin, råtta, eller kanin 3,12,13. Större djurmodeller, såsom svin och människor, ge mer kliniskt relevant data, men är mindre ofta på grund av högre kostnader, ökad biologisk variation, större volymer av blod infusionsvätskor, och biggER delar av utrustning 1,12-15. Dessutom är datainsamling svårare, särskilt för isolerade arbets hjärtan 1,3,12-15. Som ett resultat av dessa komplexa, är kliniskt relevanta isolerade hjärta modeller används sällan, ett stort hinder för utvecklingen av hjärt-translationell forskning.
I ett försök att lösa dessa komplikationer, var det isolerade arbetshjärt förberedelse modifierats för att skapa ett system som lätt kan anpassas till hjärtan av olika arter, bland annat människa, antingen under konstant tryck eller konstant flöde Langendorff förhållanden. Den afterload efterlevnad Kammaren ersattes med en centrifugalpump för att förenkla processen för justering av perfusionstryck i Langendorff läge och afterload i arbetsläge. I stället för en sluten, mantlad behållare för att innehålla hjärtat, använder detta system en öppen kammare för att göra datainsamling enklare, genom att möjliggöra användning av transapical tillvägagångssätt för konduktans kateterisering. Moreover, gör denna öppna designen tillgång till ekokardiografisk bedömning av hjärtat, ytterligare bredda de fysiologiska parametrar som kan mätas under dessa experiment. Dessa förbättringar kommer förhoppningsvis att uppmuntra andra att använda detta system för stora djur translationell forskning.
Langendorff isolerade hjärta perfusion apparater och arbetshjärtmodell har lett till några av de mest fundamentala upptäckter inom hjärt fysiologi, patologi och farmakologi. Denna modell mångsidighet möjliggör dess användning med en mängd olika arter under olika normala och patologiska förhållanden 1-18. Men den isolerade hjärtmodell inte vanligen används för stora däggdjur, särskilt mänskliga hjärtan, delvis på grund av den ökade komplexiteten i både apparater design och datainsamling. Därför, det protokoll som presenteras här visar ett försök att förbättra dessa komplikationer som resulterar i ett relativt reproducerbara sätt att studera isolerade svin hjärtan.
En viktig del av vår inställning är att ersätta arteriell compliance / afterload kammare med en centrifugalpump. Detta utbyte möjliggör förbättrad styrning av koronarperfusionstrycket och afterload i Langendorff och arbetshjärt lägen, respektivt, ger detta set-up för att enkelt anpassas till hjärtan av olika storlek och arter. Till exempel, i denna utformning, är porcina hjärtan reperfuseras vid 40-45 mm Hg, medan humana hjärtan reperfuseras vid 60-65 mm Hg. Denna förändring i tryck uppnås helt enkelt genom att justera inställningarna för centrifugalpumpen; ingen komponent i systemet behöver vara fysiskt justeras. Dessutom, placera en tryckgivare i aortaroten att övervaka root tryck möjliggör enkel övergång mellan konstant flöde och konstant tryck under Langendorff-läge. Även om denna förändring avlägsnar den klassiska överensstämmelse kammaren centrifugalpumpen genom att tillåta dubbelriktad flöde sker baserat på den tryckgradient, kan tjäna som en överensstämmelse kammaren. Med systole och utkastade slagvolym, bakåtsträvande flöde över pumpen fungerar för att minska afterload trycket, replikerar aorta elasticitet.
Den öppna konstruktionen hos denna apparat är också viktigt. Med hjärtat hängande i ett öppet area, istället för en halvslutna kammare eller tratt, gör det enklare instrumentering för mätning tryck-volym. Den öppna konstruktionen möjliggör användning av en transapical snitt för LV kateterplacering, undviker i transvalvular strategi. Det transvalvular tillvägagångssätt är tekniskt svårare, och oftast kräver genomlysning för korrekt placering. Dessutom kan denna metod också framkalla klaff insufficiens. Genom att använda transapical tillvägagångssätt vi ett säkert och enkelt placera katetern inuti den vänstra ventrikeln samtidigt som man eliminerar den extra kostnaden och besväret med fluoroskopi. Den öppna konstruktionen ger också enkel åtkomst för ekokardiografi och avloppsvatten insamling, ytterligare utöka de funktionella och biokemiska parametrar som kan bedömas samtidigt på det här systemet.
Den öppna designen, och samtidigt underlätta datainsamling, gör regleringen myocardial temperatur svårare. Att upprätthålla fysiologisk temperatur är en av de kända problem med en Langendorffeller arbetar hjärtsystemet 1,3,11,13. Langendorff Systemet innehåller vanligen en värmekammare som bidrar till att upprätthålla en lämplig temperatur, men denna kammare gör också införandet av en kammartryckvolymkateter svårare. För att lösa den underlägsna reglering av den öppna konstruktionen temperatur tillsattes en oxygenator / värmeväxlare placeras efter reservoaren. Det minimala utrymme mellan värmeväxlaren och aortakanylen reducerar värmeförlust, och myokardial temperatursond säkerställer normotermi. Användningen av mantlade rör eller externa värmekällor kan också användas för att hjälpa till med temperaturkontroll.
En annan unik del i detta protokoll är att tvätta autologt blod av grisen som studeras och rekonstituering av det med vanlig saltlösning. Även om användning av antingen helblod perfusates eller röda blodkroppar förstärkt med kristalloida buffertar är inte ovanligt, det gör det närvarande med frågor. Det förstnämnda kräver oftast en donatordjuret, som lägger substantial kostnader för försöket, medan den senare kan ha immunogenicitet frågor, eftersom det oftast kommer från bovint blod 1,11-13. Genom att tvätta den ursprungliga grisens eget blod, protokollet kräver bara ett enda djur och immunogenicitet frågor borttagen. Dessutom avlägsnar diskprocessen mest av elektrolyterna, vilket innebär att de lätt kan manipuleras per de experimentella parametrarna. Slutligen, med hjälp av en bevarandeblodenhet tar bort det mesta av proteinerna i blodet, vilket är både en fördel och nackdel med detta förfarande. Fördelen är att någon koagulering och immunologiska / infektiösa proteiner avlägsnas, vilket minskar sannolikheten för att blodklumpar eller kontaminering. Nackdelen är att denna blandning har ett lågt onkotiskt tryck, vilket kan leda till hjärtmuskel ödem och eventuellt förlust av hjärtfunktionen med tiden. Det här problemet kan åtgärdas dock genom tillsats av albumin eller annan kolloid.
Att se till att rätt storlek på ettimal och kateter har valts ut är lika viktigt som att använda en väl fungerande hjärtapparat. Helst ska katetern placeras med alla sensorelektroder kammar utrymme, med två excitation elektroder (dvs. de mest proximala elektroder) utanför kammarutrymme. Om djurets ventrikulär hålighet är för liten, eller avståndet mellan elektroderna är för stor, då alla segment inte kommer att passa inom den LV utrymme. Även placeringen av excitation elektroder kan justeras, kan en liten LV hålighet också orsaka katetern att böjas eller kurva, vilket gör datainsamling svårt. Därför, för funktionell analys av stora djur hjärtan, är ett djur storlek på minst 60 kg rekommenderas. Med ett djur av denna storlek, elektrodavstånd av 7 mm tillåter vanligtvis för fullständig införing av katetern.
Sammanfattningsvis beskriver ett isolerat arbetshjärtsystem som förenklar perfusion tryckreglering, uppgifter col detta manuskriptling, och övergripande design, samtidigt som temperaturkontroll endast något svårare. Dessa modifieringar av isolerade arbets hjärta kommer förhoppningsvis att möjliggöra dess ökade användning med stora däggdjurs hjärtan, inklusive människor, främja vår förståelse av hjärt patologi och möjliggöra mer kliniskt relevanta behandlingsalternativ på att upptäckas.
The authors have nothing to disclose.
There are no acknowledgments.
PowerLab 16/35 with LabChart Pro | ADInstruments | PL3516/P | |
MPVS Ultra Pressure-Volume Unit | ADInstruments | 880-0168 | |
Ventri-Cath Catheter (5F, 12E, 7mm, DField, Straight, 122cm) | Millar | VENTRI-CATH-507s | |
Pressure Catheter (3.5F, Single, Straight, 100cm, Ny, Non Repairable) | Millar | SPR-524 | |
PV Extension Cable (10ft) | ADInstruments | CEC-10PV | |
Catheter Interface Cable (10ft) | ADInstruments | PEC-10D | |
Rho Calibration Cuvette | ADInstruments | 910-1060 | |
MPVS Ultra BNC Cable Pack | ADInstruments | 880-0172 | |
Autotransfusion system | Sorin | 7320000 | |
Bowl Set with Low Volume (135 ml) Centrifuge Bowl | Sorin | 7135100 | |
Oxygenator/Heat Exchanger | Terumo | 3CXSX18RX | |
Perivascular flow probe | Transonic Systems | PAU Series | Size of flow probe will depend on animal size; for 60 kg pig, recommend 20 or 24 mm probe |
Perivascular flowmeter module | Transonic Systems | TS420 | |
Myocardial temerpature sensor | Smiths Medical | MTS-40015 | |
16 G 1" Regular needle | BD Inc. | 305197 | |
4-0 polypropylene suture (double-arm) | Ethicon | 8526H | For purse-string stitches |
2-0 polypropylene suture (single-arm) | Ethicon | 8833H | |
Cable ties | ULINE | S-1021 | |
Cable tie gun | ULINE | H-241 | |
Clear, Flexible PVC Tubing | VWR International | 89068 | Inner diameter depends on cannulas, pumps and other equipment used; most commonly use 1/4", 3/8" tubing |
Straight Tubing Connectors | VWR International | 46600 | |
Y-Shaped Tubing Connectors | Thermo Scientific | 6152 | |
Jacketed Bubble Trap | Radnoti | 14040 | For preload chamber |
Centrifugal pump | Maquet | 70105 | The centrifugal pump and roller pumps were obtained used from perfusion department after clinical use. |
Roller pumps | Maquet | HL-20 | |
Hemostasis Valve | Merit Medical | MAP150 | |
Blood gas analyzer | Instrumentation Laboratory | 570001000 |