Um Sistema de coração isolado para Grandes Modelos Animais

1. Construção do Aparelho Langendorff (veja a Figura 1) Usando 3/8 tubagem ", ligar o reservatório do coração para o reservatório de sangue. Certifique-se que esta tubulação passa por uma bomba de roletes. NOTA: Isto pode exigir o uso de dois 3/8 "a 1/4" conectores de tubos para criar uma peça de 1/4 "tubulação para passar pela bomba de roletes. Conecte o reservatório de sangue para aquecedor / oxigenador com 3/8 tubulação ". Use 3/8 tubos "para ligar o aquecedor / oxigenador para um conector-Y. Conecte um braço do Y-conector da bomba centrífuga, em seguida, ligue a bomba centrífuga para um segundo conector Y (todos com 3/8 "tubulação). Anexar uma peça de 3/8 "da tubagem de fixação de uma válvula hemostática para o braço virada para cima, o que vai servir como uma armadilha de bolhas e através da inserção do transdutor de pressão. Fixe um pedaço de 3/8 tubos "para o braço para baixo. Esta parte irá anexar ao aor tic cânula (isto é, a linha de pressão diastólica). Conecte o outro braço do Y-conector para a entrada da câmara de pré-carga com 3/8 tubulação ". Assegurar esta tubulação passa por uma segunda bomba de roletes. Conecte o excesso de 3/8 tubos "para a saída desta câmara. Esta parte irá anexar ao átrio esquerdo (ou seja, a linha de pré-carga). Ligar o tanque de oxigénio e um aparelho de aquecimento do aquecedor / oxigenador. Prender a linha que vai desde o conector Y para a câmara de pré-carga, que esta linha não será utilizado até que o coração é colocado no modo de funcionamento. 2. Pressão-Volume Cateter Preparação Em um banho de água a 37 C °, aquecer uma garrafa de solução salina. Embeber o transdutor de pressão PV e do cateter de condutância na solução salina quente durante pelo menos 30 min. Ligue os sistemas de aquisição de dados, permitindo que ambos aquecer por pelo menos 30 min. tle "> 3. Preparando o aparelho Langendorff Ligue o tanque de oxigênio, aparelhos de aquecimento, bomba de roletes que liga os dois reservatórios e bomba centrífuga. O aparelho de aquecimento deve ser definido como a temperatura do corpo do animal (~ 36 ° C). Lavar o sangue de acordo com as instruções do fabricante. Velocidades mais lentas de lavagem são recomendados para a remoção mais completa de produtos residuais do sangue (por exemplo, electrólitos em excesso, o material celular lisado). Quando o sangue é lavado, verificar o nível de hematócrito antes da hemodiluição. Reconstituir os glóbulos vermelhos foram lavados com uma solução salina normal para a concentração desejada do hematócrito (recomendado: 20-25%) e adicionar ao equipamento de Langendorff. Ajuste as velocidades das duas bombas para iniciar o fluxo de sangue através do sistema (excluindo a câmara de pré-carga). Verificar o pH e eletrólitos da mistura de sangue e ajuste até fisiológico para as espécies utilizadas. NOTA: Para evitar deletério emfluxo de cálcio após a reperfusão, os níveis de cálcio no aparelho de Langendorff deve, inicialmente, ser mantido baixo (0,3-0,5 mmol / L). Se há uma diminuição do hematócrito, com aumento concomitante de potássio, lactato desidrogenase e vá de hemoglobina no plasma livre para descartar a hemólise. No caso de hemólise ocorre, garantir que todas as conexões estão firmes e não há áreas de sheering óbvio. Prenda o cateter Millar no slot pressão secundária do sistema PowerLab. Calibra-se o transdutor de pressão de acordo com as instruções do fabricante. 4. Preparando o coração para fixação do Aparelho Langendorff NOTA: Um coração devidamente preso deve ser usado para todas as grandes experiências em animais envolvendo um sistema de coração isolado. Falta de parada cardioplégica pode danificar o coração de tal forma que ele não vai produzir um trabalho mensurável. Celsior, ou de baixo potássio Univerversidade de Wisconsin é recomendado solução (UW), como não são apenas estas soluções semelhantes aos utilizados clinicamente, mas o baixo nível de potássio da solução ajuda a evitar hipercalemia enquanto no circuito. Volume de solução cardioplégica vai depender do tamanho do coração, com 1 litro suficiente para corações suínos. Remover rapidamente o coração do recipiente de armazenamento, derramar qualquer solução de armazenamento nos ventrículos, secar e pesar. Para ajudar a manter a temperatura do miocárdio fria até que o coração está pronto para o Langendorff o coração regressar ao recipiente de armazenamento e orientá-lo de modo a que fique virado para cima da aorta. Insira um 3/8 "cânula na aorta e prenda com um zip-tie. 5. Colocação do coração ao Langendorff Diminuir a bomba centrífuga a um gotejamento lento. Gotejamento do sangue para a aorta até que ela está cheia de sangue e completamente sem ar. Anexar cuidadosamente o c aórticaannula ao tubo aórtico no Langendorff. Anote o tempo de fixação. Insira o transdutor de pressão calibrada pela válvula hemostática [DS1] para a aorta nativa. Comece medições de pressão e ajustar a velocidade da bomba centrífuga até que a pressão de reperfusão desejado seja alcançado. NOTA: A pressão pode mudar alterações de resistência como coronárias. Portanto, monitorar a pressão aórtica de perto, especialmente durante a reperfusão inicial. Aumentar a temperatura na unidade de aquecimento de temperatura intramio é medido a 37 ° C. NOTA: Não haverá um atraso entre os ajustes feitos para unidade de aquecimento e as mudanças nas temperaturas intramiocárdicas. Por isso, as mudanças de temperatura deve ser feito de forma incremental. Obter uma linha de base (T = 0) amostra do reservatório de sangue venoso para medir pH, eletrólitos e outras medidas bioquímicas. Insira sonda de temperatura em septo e monitorar a temperatura do miocárdio. Diminuir a temperatura da unidade de aquecimentose a temperatura do miocárdio subir acima de 39 ° C. Tome amostras de sangue a cada 15 minutos, ajustando os parâmetros fisiológicos, como desejado para o experimento. Adicionar cerca de 1 mmol de cálcio para a solução de sangue a cada 5 minutos, assegurando que o cálcio iónico é> 0,8 mmol / L, antes da iniciação de modo a trabalhar. 6. Colocar o coração no Modo de Trabalho Inserir uma cânula de tamanho apropriado para o átrio / veia pulmonar esquerda. Isso pode ser feito com qualquer um sutura em bolsa ou zip-tie, conforme apropriado. Feche todos os furos no átrio esquerdo que podem vazar, como outras origens da veia pulmonar com sutura ou grampos, conforme necessário. Ajustar a altura da câmara de pré-carga de tal modo que a altura da coluna de pressão dá a pré-carga desejada. NOTA: Supondo que a densidade da mistura de sangue / cristalóide é igual à densidade da água, 1 mmHg = 1.36 cm de distância da válvula aórtica para a parte superior dao nível de sangue no reservatório de pré-carga (p.ex., 15 mm Hg = 20,4 centímetros). Soltar o tubo vai para a câmara de pré-carga e começar lentamente a bomba de roletes de pré-carga, permitindo que a câmara de pré-carga e pré-carga da tubulação para encher completamente de sangue. Uma vez que o tubo de pré-carga é completamente sem ar, lentamente encher o átrio esquerdo e cânula com sangue. Sem permitir que o ar entre no sistema, ligar o tubo de pré-carga para a cânula da auricula esquerda. 7. Obtenção Ventricular pressão-volume (PV) Gravações Siga as instruções do fabricante para a pressão e Rho calibração tina para os sistemas de aquisição de dados. Coloque uma sutura em bolsa com uma sutura de polipropileno 3-0 no ventrículo esquerdo (VE) ápice. Usando uma agulha 16 G, fazer uma incisão dentro do cordão da bolsa. Insira a condutância cateter PV na incisão apical. NOTA: a colocação do cateter Ideal vai depacabam por ter todos os eletrodos de detecção dentro do LV e dois eletrodos de excitação fora do LV. Certifique-se de que um animal de tamanho adequado e cateter foram selecionados (ver Discussão). Pressione o botão "Iniciar" no canto superior direito para começar a gravação de dados e determinar quantos segmentos de volume estão ativos. Se todos os segmentos não estão ativos, ajuste a posição do cateter até que todos os segmentos estão ativos. NOTA: torção leve do cateter pode ser necessário para otimizar morfologia laço Se não for possível obter sinais em todos os segmentos, ajustar a localização dos eletrodos de excitação e eletrodos de sensoriamento por instruções do fabricante. Uma vez que a configuração desejada seja obtida, siga as instruções do fabricante para o volume e de calibração alfa. Utilizando um cateter devidamente calibrado, se obter, pelo menos, 30 segundos de dados de pressão e volume da linha de base. NOTA: Estes laços pressão-volume irá fornecer volume de dependênciadent medidas da função cardíaca (por exemplo, o débito cardíaco, volume sistólico). Uma vez laços suficientes são obtidos, continuar para o próximo passo, sem parar a gravação de dados, de modo a obter dados de pressão e volume de oclusão. Ocluir o tubo de pré-carga lentamente com uma braçadeira tubulação. NOTA: Os loops pressão-volume deve começar a tornar-se menor e deslocar para baixo e para a esquerda. Isso é chamado de "descer". Obter 10-15 seg da caminhada para baixo, em seguida, solte a braçadeira de tubulação para permitir a pré-carga para reinserir o átrio esquerdo. NOTA: Estes laços pressão-volume irá fornecer volume de medições independentes da função cardíaca (por exemplo, pré-carga de trabalho sistólico recrutável, sistólica relação pressão-volume final). Pare de dados de gravação, pressionando o botão "Stop" no canto superior direito da tela. Espere pelo menos 5 minutos antes de repetir ooclusão. Repita os passos 7.7 e 7.8 para obter medições repetidas.