这个视频文章介绍了已成功建立感染和分析大量斑马鱼的胚胎提供了一个新的强大的工具化合物的检测和药物发现用整体动物脊椎动物有机体的高通量管道。
斑马鱼正在成为药物发现放映临床前阶段的宝贵工具与高通量筛选的可能性整体动物模型。它们可以被用来弥补在早期阶段和基于细胞的测定法之间的间隙在体内验证在哺乳动物模型,减少,以这种方式,通过传递到测试的昂贵得多啮齿动物模型中化合物的数量。有鉴于此,本手稿中描述使用斑马鱼作为表皮葡萄球菌的研究和分枝杆菌感染的体内模型系统的新高吞吐量的管道。这种设置允许对大量同步胚的生成和分析均匀感染。此外,该管道的灵活性使用户可以容易地实现其他平台在需要的时候,以提高分析的分辨率。斑马鱼具有创新性的高吞吐量德在一起的结合chnologies打开,因为有大量的可用于破译的新化合物的作用方式提供的转基因株系的,不仅是因为使用的是整个动物模型,而且强度药物检测和发现新的可能性的领域。
迄今为止,斑马鱼( 斑马鱼 )已经成功地建立,以研究各种传染病1的有效模型。斑马鱼的胚胎提供了独特的体内成像的可能性,由于其透明度和大量表达荧光蛋白转基因存在记者行。这个强大的组合使得它可以及时跟踪不同的免疫细胞类型,同时与病原体如分枝杆菌,M的近亲互动结核2,或表皮葡萄球菌 ,生物材料相关感染3-5的主要病因。感染不同的路线可以在斑马鱼胚胎中使用根据研究6的目的。
其中一个感染途径是蛋黄注射的细菌。这种方法的主要优点相比其他的是蛋黄infecti上可以自动通过机器人注射来进行,显著减少喷射时间,并允许高的感染7,8的再现性。
以前的工作,利用斑马鱼作为对S的体内研究模型系统的高通量表皮和M.海鱼感染,证实是成功的7,8。该系统能够通过机器人蛋黄注射早期胚胎,并使用荧光读数用作细菌负荷的度量来筛查疾病的进展。在此概念的协议,这种设置得到了优化,并建立了高效高通量管道与产生大量均匀受感染的胚胎,并在与众多化合物治疗后的时间跟踪感染进展的可能性。既定的设定也能够产生高达8000同步胚胎筛选对于疾病进展,以这种方式达到每小时2500胚的处理。胚胎基于它们的细菌负荷分类的使用自动化系统,确保感染的幼虫同质群体。此外,为了验证设置,参考已知预防结核病的进展在哺乳动物的效果进行了测试感染分枝胚胎海鱼 E11株或毒性更强的M株9。
本文详细研究描述了已经成立,能够产生大量感染胚胎,并在发展和复合处理后的细菌进展的后续分析的高通量管道。
在本文中描述的高通量方法提供了一种快速和成本有效的管道来筛选大量的鱼的胚胎和幼虫的不同类型的感染。使用大的繁殖容器,而不是传统的单人或家族繁殖坦克容易控制的产卵过程和产生较大的同步蛋的数量。随着自动化微注射系统7的改进版本,它可以在相同的细胞阶段在1小时内注入高达2500鸡蛋几乎所有。有了这些更新和改进的软件是可行的注入更多的鸡蛋比以前可能是它可以用来与细菌增殖的读出进行大量药物屏幕。然而,这种方法目前还仅限于蛋黄注射液,由贝纳尔等人描述,例如其他注射途径。 (2012)6,将可望在自动化微注射系统结合在不久的将来。
<P类=“jove_content”>虽然这些方法为基准,筛选斑马鱼,它会与其它鱼种的应用程序很有用。例如,常见的鲤鱼已表明具有的优点为药物屏幕。像斑马鱼,鸡蛋和鲤鱼早期胚胎是透明的,但随着几百几千只蛋和自交系,提供更稳定的遗传背景16的可用性它的大尺寸产卵的主要优势。大量受感染的胚胎的分析是通过对高吞吐量大颗粒流式细胞仪。这种装置可以排序分析胚胎成多孔板或培养皿中使其特别适于测试大量化合物。如果需要更高的成像分辨率,比设置适合的方式,大颗粒的流式细胞仪技术可用于预筛分,并随后通过分析样品在一个中等摆在更高的分辨率。这可以使用脊椎动物自动筛分技术17,18来完成。该设备可以自动收集从多孔板或散装容器,像360°通过利用激光共聚焦显微镜或立体显微镜毛细管2和7天受精后的活的或固定的胚胎和2散装容器允许胚胎基于人工分拣再处理在显微图像。未来的改进将使得胚胎的成像到多孔板后的排序,因此使得有可能用CLSM屏幕自动大量单个胚胎的一段时间。假设在将来的应用程序的脊椎动物自动筛分技术系统也可以连接到大颗粒的流式细胞仪技术,无需事先分配幼虫的需要为多孔板,将导致一个更先进的分拣。
本文详细介绍了建立高吞吐量的设置,研究S的ð优化表皮和M.海鱼感染为模型药物发现。它表明,这些细菌注射到卵黄的结果依赖于卵在注射时的发育阶段。注入M.海鱼 E11在16-128细胞阶段或M个菌株在16-64细胞阶段导致相同的感染图案作为尾静脉注射2,6。但是这种设置并不限于只细菌病原体的增殖。有可能分别为13至机器人注入含有DNA,RNA或吗啉为转基因溶液,过表达和基因敲除的研究中,它是前图所示。另外,它表明,这种设置也用于癌症细胞增殖和迁移的研究是有用的。因此,这条管道呈现为多种信号机制的高通量筛选的背景下,一个通用的方法先天免疫的,应用于感染性疾病和癌症的发展。这些屏幕可以与他人进行药物发现也与确定适用的药物可能的毒性效应分析相结合。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢莱奥妮·德波尔和BAS Zaat(学术医学中心),为我们提供了S。表皮 O型47株。我们感谢波多黎各邦加茨,弗朗西斯迪斯和Angela昏迷(联盟Biometrica)寻求帮助和建议的COPAS XL和广阔的生物影像分析仪分析。我们感谢戴维德威特,乌尔里克Nehrdich和劳拉面包车许尔斯特鱼照料,并从莱顿大学的其他同事的有益讨论。本研究形成了生物医用材料研究所共同资助由经济事务荷兰财政部的研究计划的项目P5.03 IBIZA的一部分,和经济事务的荷兰部的智能混合编程(NWOA_6QY9BM)和荷兰教育,文化和科学。从欧盟项目ZF-健康(FP7-健康-2009-242048),获得额外的支持,以及RMJ是由居里夫人奖学金作为欧盟首次培训网络FishForPharma(PITN-GA-201有经验的研究员支持1-289209)。资源,其中SJR收到的资金从创新药物行动联合承诺项下出让协议编号为115337,是由来自欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)和EFPIA公司以实物contribution.The作者进一步确认捐款从莱顿大学基金(LUF)用于机器人和从Cyttron的财政支持,在Besluit补贴Investeringen Kennisinfrastructuur程序,而这又是经济由荷兰科学研究组织为成像设备的支持。该COPAS系统采集部分由来自荷兰科学研究组织(NWO,834.10.004)的财政援助为地球和生命科学(ALW)司的支持。
Middlebrook 7H10 agar | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 262710 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 271310 | |
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211886 | |
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment | BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA | 211887 | |
LB agar | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L5542 | Multiple suppliers |
LB broth | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | L3022 | Multiple suppliers |
Chloramphenicol | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 16785.03 | Multiple suppliers |
Hygromycin | Bio-connect, Huissen, the Netherlands | 25966.01 | Multiple suppliers |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | P1754 | Multiple suppliers |
Polyvinylpyrrolidone40 | Calbiochem, San Diego, California, USA | 529504 | Multiple suppliers |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA | A5040 | |
Agarose | Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands | S103 | Multiple suppliers |
Instant ocean sea salt | Sera Marin, Heinsberg, Germany | 5460 | |
iSPAWN | Techniplast, Buguggiate, Italy | iSPAWN | |
Automated microinjection system | Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands | Automated microinjection system | |
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | COPAS XL | |
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | VAST BioImager | |
LP Sampler | Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA | LP Sampler | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SL | |
Injection needle 10 µm inner diameter | Qvotek, Mississauga, Canada |