El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano
Summary
Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.
Abstract
Trypanosoma brucei es un parásito kinetoplastid que causa tripanosomiasis humana africana (THA), o enfermedad del sueño, y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino 1. Los suplentes de parásitos entre el torrente sanguíneo del huésped mamífero y el vector de la mosca tsetsé. La composición de muchos orgánulos celulares cambia en respuesta a las diferentes condiciones extracelulares 2-5.
Glycosomes son los peroxisomas altamente especializados en los que muchas de las enzimas que intervienen en la glucólisis son compartimentados. Cambios en la composición glicosoma de una manera regulada en el desarrollo y el medio ambiente 4-11. Actualmente, las técnicas más comunes que se utilizan para estudiar glicosoma dinámica es la microscopía electrónica y de fluorescencia; técnicas que son caros, tiempo y mano de obra intensiva, y no adaptarse fácilmente a los análisis de alto rendimiento.
Para superar estas limitaciones, un sistema indicador fluorescente en glicosomaque mejoró la proteína fluorescente amarilla (eYFP) se fusiona a una secuencia de peroxisomas focalización (PTS2), que dirige la proteína de fusión a glycosomes 12, se ha establecido. Sobre la importación de la proteína de fusión PTS2eYFP, glycosomes vuelven fluorescentes. Orgánulos la degradación y los resultados de reciclaje en la pérdida de la fluorescencia que puede ser medido por citometría de flujo. Un gran número de células (5000 células / seg) se pueden analizar en tiempo real sin extensa preparación de la muestra tales como la fijación y el montaje. Este método ofrece una forma rápida de detectar cambios en la composición orgánulo en respuesta a las fluctuaciones de las condiciones ambientales.
Introduction
Trypanosoma brucei causa la enfermedad del sueño africana en los seres humanos y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino. Los fármacos utilizados en el tratamiento de estas enfermedades son anticuadas y extremadamente tóxico, las vacunas no están disponibles, y el potencial para el desarrollo de resistencia a los medicamentos requiere la búsqueda de nuevas dianas farmacológicas 1.
Durante su ciclo de vida, T. brucei, se alterna entre un insecto vector y hospedador mamífero; dos hosts que se presentan muy diferentes entornos en los que el parásito tiene que sobrevivir. Una serie de cambios metabólicos y morfológicos se producen como el parásito está expuesto a diferentes condiciones ambientales. Algunos de los cambios más dramáticos se observan en parásitos microcuerpos específicos de una sola membrana limitada, denominada glycosomes 13.
Los niveles de glucosa son relativamente altos (~ 5 mm) en el torrente sanguíneo y parásitos en el torrente sanguíneo (BSF) generan ATP exclusivamente a través de wh glucólisisile metabolismo mitocondrial es reprimida 14. A diferencia de otros eucariotas en el que la glucólisis se produce en el citoplasma, T. brucei compartimenta mayoría de las enzimas glucolíticas en glycosomes 14,15. Los parásitos son absorbidos por la mosca tsetsé durante una harina de sangre y experimentan una caída en la glucosa, que cae a niveles indetectables en los 15 minutos de ser ingerido por la mosca. El metabolismo de los insectos, la forma procíclica (PCF), parásitos es más flexible y glucosa, así como aminoácidos tales como prolina, se pueden utilizar en la síntesis de ATP 16-18. Estudios proteómicos comparativos revelan cambios de ciclo de vida que dependen en glicosomal y proteínas mitocondriales con proteínas glucolíticos aumento en los parásitos del torrente sanguíneo y proteínas mitocondriales implicadas en el ciclo TCA y la cadena respiratoria 13,19. Mientras que muchos estudios se han centrado en las diferencias entre BSF y glycosomes PCF, se sabe poco sobre los cambios en glycosomes PCF que se producen en respuesta a envcambios ironmental.
En el intestino grueso de la marcha, los niveles de glucosa son bajos con aumentos transitorios durante una alimentación 20. En la mayoría de los estudios in vitro, los parásitos PCF se cultivan en medios que contienen glucosa. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los cambios del metabolismo PCF significativamente en respuesta a glucosa disponibilidad 17. En ausencia de glucosa, la captación de prolina y prolina aumento de la actividad deshidrogenasa 18. Este cambio en el metabolismo mitocondrial es probable que acompañado por un cambio en la composición y la morfología glicosoma, sin embargo, esto no ha sido evaluado directamente.
Electron y microscopía de fluorescencia se utilizan técnicas comunes para estudiar la dinámica glicosoma en T. brucei 2,21-24. Estos protocolos son el tiempo y mano de obra intensiva, caro, y difícil de adaptar a los estudios en tiempo real y protocolos de alto rendimiento. Para superar esta limitación, un sistema indicador fluorescente u orgánulosed para estudiar orgánulos en los sistemas de mamíferos y levaduras se ha modificado para su uso en T. brucei 12.
Sistemas de indicador fluorescente orgánulos se han utilizado ampliamente en eucariotas superiores tales como levadura, planta, y células de mamífero 25-27. En tales sistemas, una proteína fluorescente se fusiona a una secuencia de aminoácidos que se dirige a la proteína a orgánulos específicos. La degradación o síntesis de las proteínas específicas se mide a través de la fluorescencia y los cambios en la composición del orgánulo se reflejan en cambios en la fluorescencia celular.
Cuando la fase de lectura abierta de la proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) se fusiona con una secuencia focalización peroxisomal tipo II (PTS2) 12, la proteína PTS2eYFP se importa a, glycosomes maduros-importación competente y de fluorescencia pueden ser monitoreados mediante citometría de flujo. Las variaciones en la composición glicosoma se reflejan en cambios en la fluorescencia celular. Este sistema puede ayudar a resolving los mecanismos que regulan los cambios inducidos por el medio ambiente en glicosoma composición.
Este manuscrito describe la generación de un sistema reportero glicosoma en los parásitos PCF en conjunción con la citometría de flujo para controlar la dinámica de glicosoma en tiempo real en parásitos vivos y proporciona un ejemplo de cómo se ha utilizado para seguir los cambios en glicosoma composición en respuesta a diferentes entornos. En resumen, glicosoma composición está influenciada por las concentraciones de glucosa extracelular y paso de cultivos en fase logarítmica en medio fresco provoca cambios en glicosoma composición. Este sistema puede ser modificado para estudiar el comportamiento dinámico de otros orgánulos en tripanosomas y otros parásitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycosomes son, orgánulos específicos del parásito esenciales y dinámicos. Los procesos que regulan la biogénesis, mantenimiento, proliferación y remodelación de estos orgánulos probable incluyen objetivos farmacológicos que podrían ser explotadas con fines terapéuticos. A pesar de la posibilidad de alta abundancia de tales objetivos farmacológicos, el campo de glicosoma biogénesis se ha quedado atrás el estudio de procesos similares en otros organismos, principalmente debido a la falta de un sistema de al…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.
Materials
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium Chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50X) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100X) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium Biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A.Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
Referencias
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