Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
Beyin ve uzun vadeli anıları konsolidasyon deneyimleri kodlama gen transkripsiyonu bağlıdır. Kodlama deneyim spesifik genlerin işlevini belirlenmesi moleküler nörobilim ana hedeflerinden biridir. Ayrıca, belirli davranışları ile tanımlanan genlerin fonksiyonel dernek nöropsikiyatrik bozuklukların temelini anlamak için etkileri vardır. Güçlü transkripsiyon programları indüksiyonu çeşitli davranışsal manipülasyonlar ardından fare beyinlerinde gözlenmiştir. Bazı genetik elemanların farklı davranış manipülasyonlar takip eden ve farklı beyin çekirdeklerinde tekrarlı kullanılmışsa da, transkripsiyon programları genel olarak uyaran uyarılara ve 1,2 incelenmiştir edildiği yapıya benzersizdir.
Bu yayında, bir protokol davranışsal manipülasyon yanıt farelerin beyin çekirdeklerine sağlam ve kapsamlı transkripsiyon profilleme için tarif edilmiştir.Protokol Akut kokain deneyimi aşağıdaki akumbens çekirdekte gen ekspresyon dinamiklerin analiz bağlamında gösterilmektedir. In vivo deneyim tanımlanan bir sonraki hedef nöral doku disseke edilir; RNA, ardından arıtma için, çok hedefli genlerin geniş QPCR analizi için transkripsiyonu ve mikroakışkan dizilerin kullanımını ters. Bu protokol, küçük beyin numuneleri hatta tek tek hücreleri gibi kapsamlı analiz başlangıç malzemesi, sınırlı bir miktar (50-500 genlerini adresleme) yönelikse.
Protokol çok sayıda örneğin paralel analizi (örneğin, tek hücreler, ilaç aşağıdaki dinamik analizi, viral ya da davranışsal düzensizlikler) için en çok avantajlıdır. Ancak, protokol aynı zamanda mikrodiziler veya RNAseq tarafından tüm genom çalışmalarından önce numunelerin karakterizasyonu ve kalite güvencesi için hizmet, yanı sıra tam-genom çalışmalarından elde edilen verilerin doğrulama olabilir.
Introduction
Beynin dinamik bir organizasyon bilişsel ve davranışsal esneklik sağlar. Deneyimler beyindeki 3 nöronlar arasındaki bağlantıların yapısı ve gücü değişiklikleri ile kodlanmıştır. Bu "tecrübeye bağımlı plastisite" sinaptik yapı ve mukavemet 4 modifikasyonu için gerekli proteinleri içerir gen ifadesinin spesifik örneklerine indüksiyon sonucudur. Uzun vadeli anıların oluşmasına aracılık gen düzenleyici ağların tanımlanması transkripsiyonel programların egemen unsurlarının tespiti için bellek oluşumunu, yanı sıra hedefler düzenleyen temel ilkeler içgörü sağlayacağı beklentisi ile, moleküler nörobilim merkezi ilkelerinden biridir nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların tedavisi. Transkripsiyonel programlar d önemli olan farklı karakter genleri kodlayan her biri, geçici olarak tanımlanmış dalgalar açılmaksinyal olayı 1,2 sonucu uygulanmasında ifferent aşamaları. Bu kaynaklı genlerin tam bir tamamlayıcı belirlemek ve onların indüksiyon dinamiklerine göre potansiyel fonksiyon içgörü kazanmak şekilde, ayrıntılı bir zamansal zaman ölçeği üzerinde transkripsiyonel dinamiklerini ele nedenle önemlidir.
Madde bağımlılığı, beyin 5,6 nöral devrelerinde kötüye kullanılan ilaçların uzun süreli etkileri neden tecrübeye bağımlı plastisite sağlam bir şeklidir. Ilaçlara ilk akut maruz bağımlılık gelişmesinde ve kronik kullanımına geçişe yol açabilir. Bağlamsal bilgi bağımlılık gelişiminde çok önemli bir unsurdur. İlaç-ilişkili çevresel ipuçları uyuşturucu bağımlısı zihninde önem atanır. Ilaç özlem nüksü uyarabilir geçmiş ilaç deneyim bir ilaç istismarı hatırlatan bağlamsal bilgiler hatta uyuşturucu maruz 7,8 kaçınmanın uzun süre takip.Dolayısıyla bağımlılığı büyük klinik meydan – yoksunluk belirtileri 9 yatıştıktan sonra bağımlılarının eğilimi hatta uzun nüks.
Kokain Davranışsal sensitizasyon uyuşturucu bağımlılığı mekanizmalarının çalışma yararlı kokain deneyimi basit bir modeldir. Kötüye kullanılan ilaçların kronik olarak maruz kalmak neden olduğu uzun süreli sensitizasyon bu yaygın olarak incelenmiş modelinde kemirgen önce salin enjeksiyonları (karın içinden, IP) alışık olan yeni bir ortamda (kendi lokomotor aktivite kontrol edildiği bir açık alan odası) ; onların etkinliği 10 (Şekil 1) takip edilmektedir, sonra onlar açık alanda odalarına kokain günlük enjeksiyonu yapılır. Bu davranış genellikle bir paradigma sapık oluşumunu gösteren, kokain enjeksiyonları kesilmesini takiben aylık bir süre için muhafaza edilmektedir (8-12 kat başlangıç etkinliği ile elde edilmiş) Hareket davranışında, 11, sağlam bir sensitizasyon sonuçlanırilaç deneyim Asive bellek iz.
Doğal bir türün başarısı (örneğin beslenme, cinsiyet) için gerekli davranışları takviye katılan ödül nöral devreler, ilaç ilişkili davranışları 12,13 güçlendirmek için ilaç kötüye tarafından istismar edilmektedir. Kötüye kullanılan ilaçların tecrübesi arttınlır edildiği, moleküler ve hücresel mekanizmalar, başka beyin yapılarında 14 açıklayıcı bir ya da semantik bellek oluşumu altında yatan mekanizmaların benzer görünmektedir. Bu nedenle, davranışsal sensitizasyon modelinin sağlamlığı o deneyim-bağımlı plastisite mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistemi yapar.
Nükleus akumbens (NAC) beyin ödül devresinin bir merkezi birleştiricidir ve yoğun bağımlılığı 5,6 gelişmesi ile ilişkilendirilmiştir. Bağımlılığı oluşumu nukleus accumbensde yeni proteinlerin transkripsiyonu bağlıdır ve sağlamaçıkça yapılandırılmış transkripsiyon programları duction kokain deneyimi 15-19 aşağıdaki NAC görülmektedir. kokain maruz kalma akut transkripsiyonel tepkisi güçlü indüksiyon uyarana uyum ve yeni proteinlerin üretimini yönlendirmek için birden fazla düzeyde çalışması için muhtemel olduğunu ilaç 6,19-22 maruz bırakılarak kaynaklanan yapısal değişiklikler ve elektrofizyolojik sorumludur.
Beyinde tecrübeye bağımlı plastisite moleküler mekanizmalarının çalışmasını sağlamak amacıyla, bir protokol davranış manipülasyon beyin doku örnekleri transkripsiyon dinamiklerinin kapsamlı analizi için tarif edilmiştir. Transkripsiyonel analizi için mikro-akışkan dinamik bir dizi kullanarak, kokain davranışsal duyarlılaşma – protokol Citri laboratuarda araştırılmıştır davranış deneyim bağlamında görüntülenmiştir. Açıklanan protokol belli t okuyan bunlarla sınırlı değildiro davranışsal duyarlılaşma bağlamında accumbens nükleusuna, davranış paradigmalar ve beyin bölgelerinin çok sayıda uygulanabilir. Aslında, bu protokol beyin dışında, vücut dokularına tatbik edilebilir, ve deneyimlerin veya organizmanın çeşitli manipülasyon incelenmiştir.
Protokol kabaca dört aşamada ayrılır. Birinci aşamada, hayvan davranış paradigma tabi tutulur; İkinci aşamada doku microdissected olduğu; Üçüncü aşamada – mRNA tersine transkripsiyon yapılmış, saflaştırılmış ve problandı ve son aşamada veriler analiz edilir.
Transkripsiyonel dinamiklerini okuyan kapsamında, deneyim hassas zamanlama ve tanımı kontrol etmek en önemli deneysel parametreler muhtemelen. Bu nedenle, tercih edilen modeli, bu davranışsal kokaine davranışsal duyarlılaşma, deneyimi sağlanan parametreleri üzerinde kontrol deneyi ile yüksek düzeyde sağlayan bir sistem ile ilgilidirce. Deneyim-bağımlı plastisite veya bellek oluşumu farklı modeller hassas zamanlama sağlamak ve ele Ek davranışsal paradigmalar vardır. Bu modeller korku klima 23, akut çevresel zenginleştirme 24,25, roman nesne keşif 26 ve karanlık yetiştirme 27 aşağıdaki görsel deneyim içerir. Yine, kokain davranışsal sensitizasyon sürekli güçlü davranışsal manipülasyon kokain deneyimi 28 aşağıdaki ay süren oldukça yaygın bellek izleme oluşturma, olduğunu.
Beyin çekirdeği accumbensde manuel mikrodiseksiyonu takip kesilir. Hızla hazırlanan beyin dilimleri el ile mikrodisseksiyon davranışsal paradigma ilgili dokuyu çıkarma en güvenilir ve hızlı bir yöntem sağlar ki bizim deneyim olmuştur ve tecrübesi ile, doku sınırları tanınan kolayca belirgin hale gelirler. Seçenek olarak ise, ince dilimler HAZIRLIK olabilirlazer yakalama mikrodiseksiyon takip ed. Bu yöntem son derece ilgi bölgenin sınırlarının çizilmesini tanımlanan sağlar karşın, (böylece kararsız mRNA kaybetme riski) sıkıcı yavaş ve masraflı özel ekipmanları (lazer yakalama kurulumu ile donatılmış bir mikroskop) gerektirir. Burada tanımlanan protokol, yama pipetler, 29 kullanılarak görsel olarak tanımlanmış olan hücrelerin sitoplazması elle aspirasyonu ile, tek hücreli bir transkripsiyonel analizi için adapte edilebilir. Bu çoğu durumda, doku içindeki hücrelerin sadece bir alt popülasyonu, aslında deneyimine yanıt katılan son derece olasıdır, ancak tarif edilen protokolü bir popülasyon ortalama sağladığını belirtmek önemlidir. Bu deneyimi yanıt belirli bir hücre popülasyonları içinde bir seçici bir şekilde transkripsiyonu profile ilgi olduğunu, ancak bu yaklaşımların tartışılması geçerli kapsamı dışındadır.
MRNA Saflaştırma için, ters transkripsiyon ve QPCR sorgulama, dokuticari olarak temin edilebilir kitlerin kullanılması ile ve ardından ince iğneler boyunca geçirilmesi ile bozulur (Daha fazla bilgi için, bakınız Tablo 8). Seçim yüksek kaliteli RNA ve alt uygulamaları sağlam sonuçların güvenilir çıkarılmasını sağlamak, bu metodolojiler, deneyim tarafından bilgilendirilir.
Protokol kullanılarak dinamik bir dizi yüksek verimli QPCR için tarif edilmiş olmasına rağmen, numuneler son nokta PCR, düşük verimlilik qPCR, gen ifadesi ya da derin mikrodizileri dizileme, gen ekspresyonu için incelenebilir. Yüksek verimli QPCR kullanılarak dinamik bir dizi için tercih mRNA davranış paradigmaların ardından genellikle sınırlayıcı miktarda olan beyin çekirdekleri elde olmasından kaynaklanmaktadır. Dinamik diziler tek bir deneyde paralel örneklerin çok sayıda transkript etkili bir biçimde analiz sağlayan bir platform sağlar. Mikroakışkan sisteminin ilk iktisabı (genellikle kurumsal bir pu sonrarchase), deney çalıştırmak için nispeten ucuzdur. Bu analizden sonra, örneklerin daha da sorgulanması dinamik diziler kalite güvencesi için kapsamlı bir referans sağlayan (mikrodiziler veya RNAseq) tarafından yeni transkript aramak için daha maliyetli platformları kullanarak yapılabilir. Son olarak, veri analizi için, standart yaklaşımlar kullanılmaktadır. Ortaya çıkabilecek sorunları ile ilgili özel işaretçileri protokol metninde ele alınacaktır.
Bu protokol birden fazla koşul ve çoğaltır okuyan kendi ilgi sisteminin kapsamlı bir soruşturma ilgilenen araştırmacılar için en uygundur. Protokolü de zaten onlar defalarca sorgulama ilgilenen ilgi 50-500 genlerin, bir alt kümesine (microarray veya RNAseq deneyler aracılığıyla) honlanmış bazı araştırmacılar için en uygun olanıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Davranışsal paradigmaların ardından beyin dokusundan gen ifadesinin başarılı karakterizasyonu bağlıdır: davranış paradigması sırasında farelerin 1) dikkatli elleçleme; Ilgi doku 2) Hızlı ve hassas diseksiyon; 3) RNA emniyetli önlemler RNA bütünlüğünü sağlamak için; ve 4) primerleri ve deneysel dikkatli planlama düzeni gibi QPCR analiz için hazırlanırken detaylara hassas ve dikkat.
Tarif edilen prosedüre amacı, davranış deneyim ile indüklenen transkripsiyon…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
Referencias
- Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
- Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Kleim, J. A., Jones, T. A. Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage. Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).
- Kauer, J. A., Malenka, R. C. Synaptic plasticity and addiction. Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).
- Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction. Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).
- Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).
- Koob, G. F., et al. Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence. Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).
- Beurrier, C., Malenka, R. C. Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine. The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).
- Robinson, T. E., Berridge, K. C. The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view. Addiction. 95, S91-S117 (2000).
- Boening, J. A. Neurobiology of an addiction memory. Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).
- Everitt, B. J., Robbins, T. W. Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion. Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).
- Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. The addicted human brain: insights from imaging studies. The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).
- Carlezon, W. A., et al. Regulation of cocaine reward by CREB. Science. 282, 2272-2275 (1998).
- Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).
- Hope, B. T., et al. Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments. Neuron. 13, 1235-1244 (1994).
- Pulipparacharuvil, S., et al. Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity. Neuron. 59, 621-633 (2008).
- Robison, A. J., Nestler, E. J. Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction. Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C. Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence. Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).
- Nestler, E. J. The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the. National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).
- Robbins, T. W., Everitt, B. J. Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation. Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).
- Kaplan, G. B., Moore, K. A. The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).
- Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving. Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Silingardi, D., et al. ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex. Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).
- Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex. The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).
- Steketee, J. D., Kalivas, P. W. Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior. Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).
- Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nature protocols. 7, 118-127 (2012).
