Análisis Integral de Transcripción Dinámica del cerebro muestras Siguiendo Experiencia del Comportamiento

Organización dinámica del cerebro permite la flexibilidad cognitiva y conductual. Experiencias se codifican a través de modificaciones de la estructura y la fuerza de las conexiones entre las neuronas en el cerebro ^3. Esta "plasticidad dependiente de la experiencia" es el resultado de la inducción de patrones específicos de expresión genética que proporciona las proteínas necesarias para la modificación de la estructura y la fuerza sináptica ^4. La identificación de las redes reguladoras de genes mediar en la formación de recuerdos a largo plazo es un principio central de la neurociencia molecular, con la expectativa de que la identificación de los elementos dominantes de programas transcripcionales proporcionará información sobre los principios fundamentales que regulan la formación de la memoria, así como los objetivos de tratamiento de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos. Programas transcripcionales se desarrollan en ondas definidas temporalmente-, cada uno de los cuales codifica genes de distinto carácter, que son importantes para el detapas ifferent en la aplicación de los resultados del evento de señalización ^1,2. Por tanto, es importante para hacer frente a la dinámica de la transcripción en una escala de tiempo temporal detallada, a fin de identificar el complemento completo de genes inducidos, y obtener una perspectiva de su función potencial de acuerdo con la dinámica de su inducción.

La drogadicción es una forma sólida de experiencia plasticidad dependiente causada por los efectos a largo plazo de las drogas de abuso en los circuitos neuronales en el cerebro ^5,6. , La exposición aguda inicial a las drogas puede conducir al desarrollo de la adicción y la transición hacia el uso crónico. La información contextual es un elemento crucial en el desarrollo de la adicción. Señales ambientales fármacos relacionados se asignan gran importancia en la mente de los consumidores de drogas. La información contextual recordando a un adicto a las drogas de la experiencia drogas en el pasado puede inducir la recaída en el deseo de droga, incluso después de largos periodos de abstinencia de la exposición al fármaco ^7,8.De ahí el gran reto clínico en la adicción – la propensión de los adictos a la recaída, incluso mucho tiempo después de los síntomas de abstinencia han disminuido ^9.

Comportamiento de sensibilización a la cocaína es un modelo simple de la experiencia de cocaína útiles en el estudio de los mecanismos de adicción a las drogas. En este modelo ampliamente estudiado para la sensibilización de larga duración inducida por la exposición crónica a drogas de abuso, los roedores son primero habituaron a inyecciones de solución salina (intraperitoneal, IP) en un nuevo entorno (una cámara de campo abierto en el que se controla su actividad locomotora) ; entonces, que reciben inyecciones diarias de cocaína en las cámaras de campo abierto, mientras que su actividad es monitoreada ¹⁰ (Figura 1). Este paradigma de comportamiento típicamente resulta en una sensibilización robusta de comportamiento locomotor (8-12 veces por encima de la actividad de línea de base) ^11, que se mantiene durante un período de meses tras el cese de las inyecciones de cocaína, lo que demuestra la formación de un pervhuella de la memoria ASIVE de experiencia de la droga.

Los circuitos neuronales de la recompensa, que participan de forma natural en reforzar las conductas esenciales para el éxito de una especie (por ejemplo, la alimentación, el sexo), es explotado por las drogas de abuso para reforzar los comportamientos asociados con la droga ^12,13. Los mecanismos moleculares y celulares por el cual la experiencia de las drogas de abuso se mejora parecen ser similares a los mecanismos que subyacen a la formación de la memoria declarativa o semánticas en otras estructuras cerebrales ^14. Por lo tanto, la robustez del modelo de sensibilización de comportamiento hace que sea un sistema de modelo atractivo para estudiar los mecanismos de la plasticidad dependiente de la experiencia.

El núcleo accumbens (NAC) es un integrador central del circuito de recompensa del cerebro, y ha sido ampliamente asociado con el desarrollo de la adicción a ^5,6. La formación de la adicción depende de la transcripción de nuevas proteínas en el núcleo accumbens, y robusto enproducción de programas de transcripción claramente estructurados se observa en el NAc siguiente experiencia cocaína ^15-19. La respuesta transcripcional aguda de exposición a la cocaína es probable que funcione a múltiples niveles con el fin de adaptarse al fuerte estímulo de inducción y para dirigir la producción de nuevas proteínas que son responsables de los cambios estructurales y electrofisiológicos inducidos por la exposición a la droga ^6,19-22.

Con el fin de promover el estudio de los mecanismos moleculares de la plasticidad dependiente de la experiencia en el cerebro, un protocolo se describe para el análisis completo de la dinámica de transcripción en las muestras de tejido cerebral después de la manipulación del comportamiento. El protocolo se ilustra en el contexto de la experiencia de comportamiento estudiados en el laboratorio Citri – la sensibilización de comportamiento a la cocaína, la utilización de matrices dinámicas de microfluidos para el análisis transcripcional. El protocolo descrito obviamente no se limita a estudiar tque el núcleo accumbens en el contexto de la sensibilización de comportamiento, pero podría aplicarse a un gran número de paradigmas de comportamiento y regiones del cerebro. De hecho, este protocolo se podría aplicar a los tejidos del cuerpo fuera del cerebro, y una variedad de experiencias o manipulaciones del organismo estudiado.

El protocolo se divide a grandes rasgos en cuatro pasos. En el primer paso, el animal se somete al paradigma de comportamiento; en la segunda etapa el tejido es microdissected; en la tercera etapa – ARNm se purifica, inverso-transcrito y sondeó, y en la etapa final se analizan los datos.

En el contexto del estudio de la dinámica de la transcripción, el momento preciso y la definición de la experiencia son probablemente los parámetros experimentales más importantes a controlar. Por esta razón, nuestro modelo de comportamiento de elección es el de la sensibilización de comportamiento a la cocaína, un sistema que permite alto nivel de control del experimentador sobre los parámetros de la experience. Paradigmas de comportamiento adicionales que permiten la sincronización exacta y abordan diferentes modelos de experiencia-dependiente de la plasticidad o formación de la memoria están disponibles. Estos modelos incluyen el condicionamiento del miedo ^23, enriquecimiento ambiental aguda ^24,25, novela objeto de exploración ²⁶ y la experiencia visual después de la cría de oscuridad ^27. Aún así, la sensibilización conductual a la cocaína es una manipulación del comportamiento sólido y coherente, creando un rastro de memoria altamente generalizado que dura meses siguientes experiencia cocaína ^28.

El cerebro se secciona, seguido por microdisección manual de los núcleo accumbens. Ha sido nuestra experiencia que microdisección manual desde cortes de cerebro preparadas rápidamente proporciona el método más fiable y rápida de extraer el tejido correspondiente al paradigma de comportamiento, y con la experiencia, los límites del tejido hecho evidente y fácilmente reconocido. Alternativamente, rebanadas finas podrían ser prepared, seguido por láser de microdisección de captura. Aunque este método permite altamente definida la delimitación de la zona de interés, es lento (arriesgando así la pérdida de mRNA lábil), tedioso y requiere equipo especializado costoso (un microscopio equipado con una configuración de láser captura). El protocolo definido en este documento también podría ser adaptado para el análisis transcripcional de una sola célula, por aspiración manual de citoplasma de las células identificadas visualmente utilizando pipetas de parche ^29. Es importante señalar que el protocolo descrito proporciona un promedio de la población, mientras que es muy probable que en la mayoría de los casos, sólo una subpoblación de las células dentro del tejido son en realidad implicado en la respuesta a la experiencia. Es de interés para el perfil de transcripción de una manera selectiva desde dentro de las poblaciones de células específicas que responden a la experiencia, pero la discusión de estos enfoques está más allá del ámbito actual.

Para la purificación de ARNm, transcripción inversa y qPCR consulta, el tejidose interrumpe al pasarla a través de agujas finas, seguido de la utilización de los kits disponibles en el mercado (para más información, véase el Cuadro 8). La elección es informado por la experiencia con estas metodologías, que aseguran la extracción fiable de ARN de alta calidad y resultados sólidos de las aplicaciones posteriores.

Mientras que el protocolo se describe para alto rendimiento qPCR utilizando matrices dinámicas, las muestras pueden probaron para la expresión génica usando PCR de punto final, de bajo rendimiento qPCR, microarrays de expresión de genes o la secuenciación de profundidad. La preferencia por qPCR de alto rendimiento utilizando matrices dinámicas es debido al hecho de que el ARNm obtenido a partir de núcleos cerebrales después de paradigmas de comportamiento es a menudo de cantidades limitantes. Las matrices dinámicas proporcionan una plataforma que permite el análisis global eficiente de las transcripciones de un gran número de muestras paralelas en un solo experimento. Después de la adquisición inicial del sistema de microfluidos (comúnmente un pu institucionalrchase), los experimentos son relativamente baratos para funcionar. A raíz de este análisis, además de consulta de las muestras se puede realizar utilizando las plataformas más costosas para buscar nuevas transcripciones (por microarrays o RNAseq) con las matrices dinámicas que proporciona una referencia completa para el aseguramiento de la calidad. Finalmente, para el análisis de datos, se utilizan enfoques estándar. Punteros específicos relativos a cuestiones que puedan surgir serán discutidos en el texto del protocolo.

Este protocolo es el más apropiado para los investigadores interesados ​​en una investigación a fondo de su sistema de interés, el estudio de múltiples condiciones y repeticiones. El protocolo también es la más adecuada para los investigadores que ya han perfeccionado en (a través de microarrays o RNAseq experimentos) en un subgrupo de 50 a 500 genes de interés, que están interesados ​​en la consulta de forma repetida.