에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em> 대장균</em
Summary
엘라스틴 같은 폴리펩티드는 재조합 단백질 정제의 약물 전달에 이르기까지 다양한 응용 프로그램과 자극 – 반응 생물 고분자 물질이다. 이 프로토콜은 크로마토 그래피를 간단한 대안으로 그들의 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동을 이용하여 대장균에서 엘라스틴 같은 폴리펩티드 및 그 펩티드 또는 단백질 융합체의 정제 및 특성을 설명한다.
Abstract
엘라스틴 같은 폴리펩티드 특징 전이 온도 이하로서 수용성 unimers 기존 그들의 전이 온도 이상 마이크론 스케일 코아세르베이트로 집계 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동을 나타낼 반복적 바이오 폴리머이다. 유전자 수준에서 엘라스틴과 같은 폴리 펩타이드의 디자인은 자신의 열 특성을 지시 그들의 순서와 길이의 정밀한 제어를 허용합니다. 엘라스틴 같은 폴리펩티드는 바이오 센싱, 조직 공학 및 ELP의 전이 온도 및 생체 고분자의 구조는 또한 특정 애플리케이션에 대해 튜닝 될 수 약물 전달을 포함한 다양한 애플리케이션에 사용된다. 또한, 엘라스틴 같은 폴리펩티드의 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동은 열 반응에 의해 그 자신의 정화를 허용 선택적 코아 세르 베이션 및 resolubilization 허용되도록 모두, 수용성 오염 물질의 제거의 대장균에서 발현 다음. 이 접근법은 엘라스틴 같은 폴리펩티드 단독으로 또는 유 전적으로 엘라스틴 같은 폴리펩티드 태그에 첨부 된 재조합 펩타이드 또는 단백질 크로마토없이 정제 될 수 펩타이드 또는 단백질 융합체를위한 정제 도구로의 정제를 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 엘라스틴과 같은 폴리 펩타이드 및 그 펩타이드 또는 단백질 융합의 정화를 설명하고 순수한 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 제품의 열적 거동을 평가하는 기본 특성 기술에 대해 설명합니다.
Introduction
엘라스틴 같은 폴리펩티드 (ELPs)는 X, 숙박객 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 임 반복 펜타의 VPGXG 이루어지는 바이오 폴리머이다. ELPs 전시 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 상전이 거동, 균질 ELP 용액 일반적 ELP 문헌 1에서 역 전이 온도 (T의 t)라고 그 LCST로 가열하여 두 단계로 분리하는 것 등. 2 개의 상을 매우 묽은 ELP의 구체 상과 ELP 풍부한 침전물 단계로 구성된다. ELP 풍부한 침전물이어서 유착 미크론 크기의 입자로 ELP 사슬의 응집시 짧은 시간 척도에 형성된다. 이 문제는 몇 ℃의 범위에서 발생하고, 균일 한 용액 T를 t 이하의 온도로 복귀시 회수로서, 일반적 가역적이다.
ELPs는 일반적으로 아프로 대장균 (E. 콜라이)에서 합성된다발현 플라스미드로 결찰 된 인공 유전자를 해요. 이 플라스미드는 다음 E.로 변신 단백질 발현을위한 최적 대장균 세포 라인. 우리는 독점적으로 E.에 ELPs의 큰 다양성의 표현 T7-락 애완 동물 벡터 시스템을 사용했습니다 대장균, 효모 2-4, 곰팡이 5, 식물 6-8의 다른 표현 시스템이 다른 연구자에 의해 이용되어 있지만. 방법의 수는 유 전적으로 재귀 방향 결찰 (RDL) 9, 플라스미드 재건 (PRE-RDL) (10)에 의해 순환 방향 결찰을 포함, 반복적 인 ELP 유전자를 구축에 존재하고, 확장 압연 원형 증폭 (OERCA)를 11 겹칩니다. 유전자 수준에서 ELPs을 설계하는 능력은 추가 기능이 추가 될 수있는 다양한 아키텍처 (예, 모노 블럭, 디 블록, triblocks 등)로 ELPs를 만드는 재조합 DNA 기술을 사용하는 기회를 준다펩타이드 및 단백질. 유전자 수준에서 제어는 각 ELP는 완벽하게 단 분산 생체 고분자의 제품을 제공, 정확한 길이와 유전자 플라스미드 템플릿에 의해 결정 성분으로 표현되도록합니다.
각 ELP의 열적 특성은 분자량 (MW) 및 시퀀스뿐만 아니라, 그 용액의 농도 등의 염과 같은 다른 cosolutes의 존재 등 외적 요인으로서 생체 고분자에 고유 파라미터들에 달려있다. ELP (12)과 그 숙박객 잔류 조성물의 길이가 1, 13, 14, 소수성 숙박객 잔기 및 긴 사슬 길이가 낮은 T의 t 초 초래할 T의 t를 제어하는 데 사용될 수 ELP 디자인이 직교 파라미터 반면 친수성은 게스트 잔류 짧은 사슬 길이가 높은 T의 T s의 결과. ELP 농도는 반비례의 T t, GR의 해법 관련된공룡 ELP 농도가 낮은 T의 T의 12가있다. 염의 종류 및 농도는 염의 효과 Hofmeister에서 시리즈 (15)를 다음과 ELP T의 t를, 영향을 미친다. 코스모 트로픽 음이온 된 (C1 – 그리고 Hofmeister에서 시리즈 이상) ELP T (T)를 낮추고 증가 소금 농도는이 효과를 향상시킵니다. 이러한 고유 및 비 고유 파라미터 ELP의 특정 어플리케이션에 필요한 목표 온도 범위 내에서 열적 거동을 얻기 위하여 조정될 수있다.
ELPs의 자극에 반응하는 동작은 바이오 센서 (16, 17), 조직 공학 (18) 및 약물 전달 (19, 20)를 포함하여 다양한 애플리케이션에 유용하다. ELPs는 유전자 수준에서 펩티드 또는 단백질에 융합되는 경우 또한, ELP 재조합 PEP 정화용 저렴 배치 방법을 제공하는 간단한 정제 태그로서 역할을 할 수더 크로마토 그래피 (21)를 필요로하지 않는다 조수 또는 단백질. 정제 공정의 변형 ELP에 융합 된 펩티드 또는 단백질의 활성이 유지되는 것을 보장한다. 펩티드 또는 단백질 ELP 융합체는 ELP 태그 (22), (23) 또는 대안 적으로, 프리 펩티드 또는 단백질이 필요한 경우, 단백질 분해 효소 인식 부위가 펩티드 또는 단백질과 ELP 사이에 삽입 될 수있는 유용한되는 애플리케이션에 정제 할 수있다. ELP 태그의 제거는 자유 프로테아제 또는 후자 대상 펩티드 또는부터 ELP 태그와 프로테아제 ELP 융합을 분리 할 수 ELP 정제의 최종 라운드로 처리 부가 용이성을 제공 프로테아제 ELP 융합체와 소화함으로써 달성 될 수있다 단일 단계 (24, 25)의 단백질. 다음 프로토콜은 자신의 열 특성에 의해 ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합의 정화 과정을 설명하고 특성화를위한 기본 기술에 대해 설명합니다ELP 제품의 열 반응.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELPs은 자극 – 반응 단계 행동의 착취에 의한 정화의 저렴하고 크로마토 그래피 – 무료 수단을 제공합니다. 이 접근법은 E.있는 유전자에 의해 코딩 ELPs 발현 후 양, 수용성 오염 물질을 제거하기 위해 ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합체의 LCST 거동 활용 대장균. 정화이 용이성 다양한 용도 ELPs을 생산하는 데 사용될 수 있거나, ELP 사후 정화 처리로 제거 될 수있다 정제 태그로서 동작 할 수있는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 정제를 위해 이용 될 수있다.
ELP 정화는 E.을 용해하는 예비 단계를 포함 대장균과 ITC에 의해 잔류, 수용성 오염 물질의 제거 (그림 2) 다음에 조 문화 해물 (그림 1)에서 게놈과 불용성 세포 파편을 제거합니다. 원심 분리 ADDI하여 ELP 전환을 트리거 후열이나 소금의 기이 단계는 뜨거운 스핀이라고에서, 상층 액에 용해 오염 물질 ELP를 분리합니다. ELP를 resolubilizing 후, 용액, 불용성 펠렛 오염물을 제거하기 위해 T를 t 이하의 온도에서 다시 원심 분리 단계에서 냉 스핀을 칭했다. 따뜻한 스핀을 교류하는 것은 양보 할 수있는 작은 비용으로, 각주기 ELP 솔루션의 순도를 향상시킵니다. 정화 금리는 ELP T 티셔츠, 길이 및 융합 펩타이드 또는 단백질에 따라 다릅니다. 일반적으로이 프로토콜은 E. 리터당 정제 ELP 100 밀리그램을 산출 대장균 문화는, 그러나 수율은 500 ㎎ / L.까지 도달 할 수있다 ELP 제품의 최종 순도 SDS-PAGE (그림 3)에 의해 확인된다. 정제 된 ELP의 MW는 ELP 유전자에 의해 코딩 이론 MW와 밀접하게 일치해야합니다. 그러나 일부 ELPs는 예상 MW 9, 27보다 최대 20 % 높은 겉보기 MW와 SDS-PAGE로 이동한다. ELP의 더 정확한 분석MW는 또한 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)와 같은 직교 분석 기법과 함께 ELP 제품의 순도에 대한 추가적인 정보를 제공 할 수있는 MALDI-TOF-MS에 의해 달성 될 수있다.
정제 후, ELP T의 t는 온도 프로그램 된 탁도에 의해 측정된다. 온도가 증가하면서이 기술 ELP 용액의 OD를 모니터링한다. 는 ELP의 의도 된 응용 프로그램과 관련된 농도 시리즈의 특성을하는 것이 좋습니다 있도록 T의 T 농도 의존적이다. ELP는 탁도 프로필 unimer 미크론 크기의 집계에서 ELP의 전환에 대응하는 하나의 급격한 증가 (그림 4A)를 나타내는 단일 중합체를 들어. T의 t 정확하게 온도에 대한 OD의 제 유도체의 최대로서 결정 탁도 프로파일의 변곡점에 대응하는 온도로서 정의된다. 의 가역성ELP 위상 천이 온도 T를 t (도 4b) 이하로 하강 할 기준 OD의 감소에 의해 확인된다. 온도 경사를 증가 및 감소와 탁도의 프로필로 인해 ELP의 코아세르베이트 및 ELP의 resolubilization의 변수 이력의 정착에 크기와 반응 속도에 차이가 있습니다. 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합 유사 ELP 융합 펩타이드 또는 단백질이 T의 T에 영향을 미치는이 방법에 LCST 동작을 나타냅니다. 단백질 ELP는 전이 단백질의 용융 온도 아래 리버시블 융합체이다. 온도 프로그램 된 탁도는 시차 주사 열량계 (DSC)와 같은 ELP 제품, 대체 기술의 초기 열 특성화 우수한 방법이지만, 또한 ELP T의 t를 측정하는데 사용될 수있다.
또한 온도 PROGRA 특징으로 할 수있는 더 복잡한 구조의 전시보다 복잡한 열 행동과 ELPsmmed 혼탁. ELP 디 블록 공중 합체는, 예를 들어, 자신의 임계 미셀 온도에서 구면 미셀로 그들의 온도 트리거 자기 조립에 대응하는 특징적인 탁도 프로파일을 나타낸다. 이러한 ELP의 디 블록 공중 합체의 경우 OD는 일반적으로 먼저 높은 온도에서 OD의 급격한 증가 (최대 2.0 단위 기준 이상) 마이크론 스케일의 형성을 나타냅니다 후 미셀에 unimers의 전환을 나타내는 기준선 위의 0.1 ~ 0.5 단위 증가 집계 (그림 5A). 온도 트리거 자기 조립 ELP 구조에 대한 추가 정보는 DLS 솔루션에 ELP 어셈블리의 R의 H를 측정하는 기술로 얻을 수있다. R H의 변화는 탁도 (그림 5B)로 측정 OD의 변화와 밀접하게 동의합니다. 나노 입자 어셈블리 R H에게 전시 R의 H ~ 20 ~ 100 nm의 집계를 전시하면서 ELP의 unimers는 일반적으로 R H <10 nm의 전시 </suB >> 500 nm의. 이러한 응집 수와 형태 등의 자기 조립 ELP 나노 입자에 대한 추가 정보는, 정적 광 산란 또는 극저온 투과형 전자 현미경으로 17, 23, 29에 의해 얻어 질 수있다.
ELP 인해 열적 특성 조정 기능을, T를 t (S)의 범위는 다양 ELP 설계에 의해 얻어진다. 그것은 고유의 T (T)가 매우 낮거나 높은 T의 T (S)가이 표준 프로토콜에 가장 수정이 필요합니다 각 ELP에 대한 정화 프로토콜의 최적화에 영향을 미친다는 점을 명심해야합니다. 매우 높은 전이 온도를 가진 ELPs는이 방법 정화에 적합하지 않은 경우가 있습니다. 신규 ELPs 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합체의 디자인 ELP의 열 반응을 손상시킬 수있는 경우, 간단한 히스티딘 태그가 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피에 의한 정제를 위해 대체 포함될 수있다. 또한,게스트 잔류가 부과되는 경우 ELP 시퀀스의 특성은이 프로토콜의 수정을 필요로 할 수있다. 버퍼의 pH 조작은 오염 물질 (17)의 정전 상호 작용을 제거하기위한 노력으로 ELP의 전체 전하를 변경하는 방법으로서 사용될 수있다. 또한,이 프로토콜은 펩티드 및 적절한 조치가 정제 공정이 융합 잔기 활동을 교란되지 않는 보장 찍힌다 단백질과 ELP 융합체 중 특별한 상황에 적합하다. 이러한 변형의 프로토콜에 걸쳐 참고 T의 T, 책임, 또는 융합 문제와 관련하여 이러한 과제를 제시 할 수있다 ELPs의 정화를 지시하는 역할을한다.
그들의 LCST 거동 의해 ELPs의 정제 E. 표현 ELPs 대다수 펩타이드 또는 단백질 ELP 융합체를 정화하는 간단한 크로마토없는 접근법을 제시 대장균. 여기에 요약이 프로토콜은 정화 (을)를 허용F 가장 생물학 실험실에 공통 장비를 사용하여 하루에 ELPs. ELPs과 그 융합의 정제의 용이성, 우리는 희망, 재료 과학, 생명 공학, 의학의 새로운 애플리케이션을위한 ELP 디자인의 계속 성장하는 다양성을 격려 할 것이다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NSF의 리서치 트라이앵글 MRSEC (DMR-1121107)에 의해 지원되었다.
Materials
| pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
| Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
| Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
| Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
| Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
| Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
| Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels. |
| Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
| Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |
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