Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em> Escherichia coli</em

1.. ELP Anlatım Bir DMSO hisse senedi veya E. agar koloni steril Müthiş Broth medya 3 ml inoküle T7-lac promotörünün kontrolü altında, istenen ELP kodlayan plazmid içeren protein ekspresyonu için uygun coli. Uygun antibiyotik eklemek ve sürekli 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de, gece boyunca (O / N) de inkübe edilir. 4-L bir şişe içinde Terrific Broth ortam steril 1 L O / N kültürün 1 ml ilave edilir. Uygun antibiyotik eklemek ve sürekli 200 rpm'de çalkalanarak, 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Not: Kültür 24 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır halinde T7-lac promotör ile görülen "sızıntılı" taban ifade ELPS çok yüksek seviyede ifade edilmesi için yeterlidir. Kültürün optik yoğunluğu 0,6 ulaştığında, protein sentezleme daha 0.2-1 mM izopropil-p-D-tiyogalaktozid (IPTG) eklenmesiyle endüklenir burada Ancak, daha geleneksel bir yaklaşım kullanılabilir. </li> 2,000 x g de 15 dakika süre ile 4 ° C'de bir 1-L santrifüj şişesi ve santrifüj 4-L şişesi kültür aktarın. Süpernatant atın. NOT: kültür fazla 1 L yetiştirilir onlar topağa kültürünün diğer bir litre eklenmesi ve adım 1.3 tekrarlanarak yoğunlaştırılabilir. Kültür kadar 2 L tek bir hücre peleti olarak yoğunlaştırılabilir. 50 ml konik tüp hücre süspansiyonu ve 45 ml transfer ulaşmak için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), su, ya da diğer arzu edilen tampon içinde pelletini. 2 ELP Arıtma:. Ön Adımlar ve Ters Geçiş Bisiklet Birinci Turu Buz üzerinde örnek tutarken, 10 'açık', saniye ve 85 W bir çıkış gücünde 20 saniye "kapalı" döngüleri 9 dakikalık bir toplam için yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücre pelletini sonikasyon. Kısaca Numune buz üzerinde soğutulur ve daha sonra bir kez daha en az 9 döngü tekrar izin verir. NOT: ELP çok düşük T t olması bekleniyorsa </sub> 'kapalı' aralık T t yukarıdaki çözümün ısınmayı önlemek için 40 saniye kadar artırılabilir. Alt santrifüj tüpüne yuvarlak bir 50 ml lizat aktarın. Kültürün her bir litresi için,% 10 2 ml (w / v), polietilenimin (PEI) ekleyin ve karıştırın için sallayın. Not: PEI negatif yüklü genetik kirletici yoğunlaştırılmasıyla yardımcı olan, pozitif yüklü bir polimerdir. PEI da yoğunlaşmasına ve ELP ürün kaldırmak olabilir ELP negatif yüklü ise bu adımı yapmayın. 16000 x g ile 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj. Alt santrifüj tüpü yuvarlak temiz bir 50 ml süpernatant aktarın ve pelet atın. İsteğe bağlı adım "out Bake": denatüre protein kirlilikleri ve daha sonra ELP tamamen çözündürülmüş kadar 4 ° C ya da buza transferi için 10 dakika boyunca 60 ° C 'de örnek inkübe edin. Santrifüj 16.000 x g de 10 dakika süre ile 4 ° C 'de örnek. Bir cl süpernatant aktarınyuvarlak ean 50 ml alt santrifüj tüpü ve pelet atın. NOT: Bir peptid veya protein ELP kaynaşmıştır ve yüksek ısı durumda denatüre bekleniyor eğer bu adımı yapmayın. Bu ELP geçiş ısı geri dönüşümsüz veya kaynaşık yarımının aktivitesini yok edebilir neden olabilir. Kristal NaCl ilave (değil 3 M aşan) ile ELP geçişi Induce. Seçenek olarak ise, (değil 0.3 M geçmeyen) bir sodyum sitrat daha fazla T t lar ya da düşük verimli olması ELPS için kullanılabilir. NOT: Tuz çözündükten sonra çözelti çözeltiden ELP faz ayrımını işaret bulanık dönmelidir. Yüksek T t s ile çok hidrofilik ELPS ELP geçişin bu ön indüksiyonunda ELP faz separasyonunu indüklemek için, tuz ilavesi ile bir arada, bir dereceye kadar ısıtma gerektirebilir. 16.000 xg (sıcak spin) 10 dakika oda sicakliginda (RT) santrifüj. NOT: Bir ELP pelet b gerekire, boyutu ELP salgılanma verimine bağlıdır görülmektedir. Bu ELP pellet ilk opak görünebilir, ancak soğutma sonra saydam görünür ve kahverengi renkte olabilir. Arıtma gelirleri ve pislikleri gibi ELP pelet daha renksiz olacak. Süpernatant atılır ve pelet istenilen tamponun 1-5 ml ekleyin. Pipetleme pelletini veya 4 ° C'de döndürmek için tüp ayarlama Not: tampon gerekli olan hacim ELP topak boyutuna bağlı olacak ve böylece tampon yeterli miktarda ELP pelet yeniden çözündürülmesi için izin vermek için ilave edilmelidir ELP ifade, verim. Kirletici proteinleri ile disülfıd etkileşimleri ortadan kaldırmak için, pH 7, 10 mM Tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP-HCl), su ile arıtma yüksek sistein içeriği yarar ELPS. Ayarlanmış bir pH arıtma yüksek ücret içeriği parası ile ELPS onların yükünü nötralize ve taşırıcı azaltmak içinkirletici proteinlerle ctrostatic etkileşimleri. Temiz 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine 1 ml alikotlar içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ELP çözüm aktarın. 16000 x g'de (soğuk sıkma), 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj. Çözünmeyen maddelerden küçük bir pelet dikkat edilmelidir. Temiz bir tüpe aktarın ve süpernatant pelet atın. . 3. ELP Arıtma: Ters Geçiş Cycling sonraki turlar Isı ve / ya da NaCl ilavesi ile ELP geçiş neden. Numuneler T t üstünde bir sıcaklıkta 15 dakika boyunca bir ısı bloğu ya da bir su banyosu içinde inkübe edilebilir. Bununla birlikte, ELP (ısı kullanımını engelleyen) bir proteine ​​kaynaştırılmış ya da ELP tek başına ısı ile ulaşılamayan yüksek bir T t, NaCI, 5 M çözelti varsa uyarılması için damla damla ilave edilebilir ise ELP geçiş. Not: Çözelti, çözeltiden ELP faz ayrımını işaret bulanık dönmelidir. <li> 16.000 xg (sıcak spin) 10 dakika santrifüj. Isı aşama 3.1 'de kullanılmış ise, ELP geçiş sağlamak için gerekli olan bu da daha yüksek bir ısıda Bu santrifüj adımı gerçekleştirmek. Tek başına NaCl aşama 3.1 'de kullanılmış ise, oda sıcaklığında Bu santrifüj adımı gerçekleştirmek. NOT: Bir ELP pelet dikkat edilmelidir. , Süpernatant atılır istenilen tamponun 500-750 ul ekleyin ve pipetleme pelet tekrar süspansiyon ya da 4 ° C 'de döndürmek için tüp ayarlama 16000 x g'de (soğuk sıkma), 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj. Çözünmeyen maddelerden küçük bir pelet dikkat edilmelidir. Temiz bir tüpe aktarın ve süpernatant pelet atın. Hiçbir kirletici pelet adım 3.4 sırasında gözlenen kadar tekrarlayın 3,1-3,5 adımları. 4. Post-arıtma İşleme (isteğe bağlı) Eğer arzu edilirse, saflaştırılmış ELP çözeltisinden fazla tuzu çıkarmak için uygun bir tampon maddesine karşı diyalize örnek. Not: liyofilize edilecek ELPS olmalıdır4 ° C'de 2 GKD OO / N karşı diyaliz Arzu edildiği takdirde, önce, O / N liyofilize için 30 dakika boyunca -80 ° C 'de bir solüsyonun dondurulması ile uzun süreli depolama için liyofilize edilir ELP Not: Liyofilizasyon ekteki proteinlerle ELPS için kullanılmamalıdır. Eğer arzu edilirse, ELP etiketi kaldırarak bir peptid ya da protein ELP füzyon serbest peptid veya proteinin geri kazanılması: (Proteaz tedarikçi tarafından tavsiye edildiği gibi) biyotinlenmiş proteaz ile ya da genetik olarak peptit veya protein ve ELP arasında tasarlanmış proteaz sitesine karşılık gelen bir proteaz ELP füzyonu ile peptid ya da protein ELP füzyon Digest. Mevcut ise, (proteaz tedarikçi tarafından tavsiye edildiği gibi) streptavidin ile modifiye edilmiş boncuklar kullanılarak biyotinile proteazı çıkarın. 5 M NaCl çözeltisinin damla damla eklenmesiyle ayrılır ELP ve / veya proteaz ELP füzyon geçiş Induce. 16000 x g ile 10 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin. NOT: Bir ELP pelet dikkat edilmelidir. Süpernatant toplayın ve ELP pelet atın. Arzu edilen bir tampon maddesine karşı süpernatantı Dialyze veya saf peptit veya protein çözeltisinden yüksek tuz konsantrasyonu çıkarmak için bir tampon değişimi gerçekleştirmek için bir santrifüj filtre kullanmak. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ELP etiketi serbest peptid veya proteinin tam bölünme teyit edin. 5. karakterizasyonu:. SDS-PAGE 2-merkaptoetanol ihtiva eden numune tampon maddesi 10 ul su içerisinde seyreltilmiş 10 ul ELP karıştırılarak SDS-PAGE için ELP numune hazırlayın. Not: ELP 40 ug genellikle ELP ürünün boyutu ve saflığı değerlendirmek için yeterlidir. 2 dakika boyunca 100 ° C'de inkübe edin ve numune daha sonra, uygun boyutlu protein merdiven ile birlikte bir poliakrilamid jel üzerine yerleştirin. Renk verici madde jelin (yaklaşık 45 dakika) alt yaklaşana kadar 180 V jel çalıştırın. Lekesallanan ise, 5 dakika boyunca bir 0.5 M CuCl 2 solüsyonu ile jel. NOT: Bazı ELP dizileri, bu boya ile etkileşmeyen gibi ELPS tipik haliyle, Coomassie Parlak Mavi leke ile görünür değildir. Coomassie Brilliant Blue arginin kalıntıları ile esas olarak etkileşim ve temel kalıntılar-histidin ve lisin ve aromatik artıkların-triptofan, tirozin, fenilalanin ve 26 ile zayıf bir şekilde etkileşime girer. Böylece ELPS ve peptit ya da protein füzyonları ELP primer sekans Bu özel artıklar yeterli bir dizi içerir, sadece Coomassie Parlak Mavisi ile boyanmış olabilir. ELP bandın MW ELP geninden ve herhangi bir yabancı kirletici grupları mevcut olduğu beklenen teorik MW tekabül emin olun. NOT: Bazı ELPS kendi beklenen MW 9, 27 den% 20'ye kadar daha yüksek bir MW'da göç. 6. Özellik belirlemesi:. Matris destekli lazer desorpsiyon /iyonizasyon Time-of-Flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) Yaklaşık 25 uM bir ELP konsantrasyon elde etmek için% 0.1 trifluoroasetik asit içeren% 50 sulu asetonitril bir ELP çözelti hazırlayın. Not: ELP, saflaştırma işleminden sonra, H2O karşı diyaliz gerekir böylece bu çözelti, tuz arındırılmış olması gerekir. % 0.1 trifloroasetik asit içeren% 50 sulu asetonitril içinde doymuş sinapinik asit, bir matris çözeltisi hazırlayın. Yaklaşık olarak 2.5 pmol / ul bir ELP konsantrasyon elde etmek için matris solüsyon 9 ul ELP çözeltinin 1 ul ekleyin. Not: Bu karışım, bundan başka, MALDI-TOF sinyal optimize etmek matris solüsyon ile seyreltilebilir. Mevduat 1-2 metal MALDI tabağa ELP-matris karışımı ul ve nokta tamamen kurumasını bekleyin. ELP oranı (m / z) şarj ve ölçülen MW anlaması için kütlesini belirlemek için MALDI-TOF ile 5-10 spektrumları elde. 7. Characterization: Sıcaklık programlı Turbidimetri ve Dinamik ışık saçılımı Sıcaklık programlı türbidimetrisi ile ELP ait T t belirleyin: Istenilen tampon ELP çözümler (5-100 uM örn.,) bir seyreltme serisi hazırlanır. Sıcaklık kontrollü bir UV-Vis spektrofotometre kullanılarak, 1 ° C / dk 'lık bir ısıtma hızında sıcaklıkları (örneğin, 20-80 ° C), bir aralığı üzerinde 350 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçün. NOT: OD hiçbir artış görülürse T t enstrümanın üst sıcaklık sınırını aşabilir. Belirgin T t NaCI eklenerek azaltılabilir. 1 M NaCl ile başlayın ve ELP geçiş ölçülebilir bir sıcaklık aralığı içinde tespit edilene kadar 0.5 M adımlarla artar. 1 ° C / dk bir soğutma oranında sıcaklığın aynı aralığında OD azalmayı ölçerek ELP geçişin geri döndürülme oranı kontrol edin. Homo ve T t belirleyinPolimer ELP bulanıklık profili bükülme noktasının belirlenmesi ile (OD sıcaklığa göre çizilmiştir.) NOT: Bu sıcaklık kolayca türevinin maksimum karşılık gelen sıcaklık T olarak T gibi tanımlanmıştır OD eğrisinin türevinden tanımlanabilir. Daha karmaşık ELP mimarileri daha karmaşık bulanıklık profillerini görüntüler ve bölüm 7.2 'de anlatıldığı gibi detaylı analiz edilmelidir. Daha karmaşık bir termal özellikleri (küresel miseller halinde kendi kendine birleşebilen ör ELP ikili blok kopolimerleri) göstermek ELPS ilave vasıflandırmanın dinamik ışık saçılımı (DLS) ile elde edilir: Istenilen tampon içinde bir ELP çözelti hazırlayın ve 20-450 nm gözenek boyutuna sahip bir filtre boyunca örnek geçmektedir. NOT: filtre gözenek boyutunun seçimi çözelti içinde herhangi bir ELP düzeneklerinin varlığı, boyutu ve kararlılık bağlıdır. En küçük uygun filtre gözenek boyutu gibi kirletici maddeleri ortadan kaldırmak için tercih edilir,DLS ölçümleri kalitesini azaltmadığını toz. Küçük filtre gözenek boyutları arasında bir ELP çözüm geçerken önemli bir direnç yaşadığı zaman daha büyük bir filtre gözenek boyutu kullanılmalıdır. Bulanıklık profili tespit ilgi bölgeye karşılık gelen bir sıcaklık aralığı üzerinde hidrodinamik yarıçapı (R H) ölçün. NOT: ELP unimers genellikle R, H <10 nm, nanoparçacık meclisleri bir R, H ~ 20-100 nm var, ve agrega bir R H var> 500 nm var. R, H, her bir artış, parçacığın büyüklüğü ile orantılı olan sıcaklığın bir fonksiyonu olarak UV-Vis spektrofotometre ile ölçülmüştür 350 nm'de OD bir artışa karşılık gelmelidir.