Hot Catálisis Biológica: Calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar las reacciones enzimáticas
Summary
Medidas de calorimetría de titulación isotérmica flujo de calor liberado o absorbido en las reacciones químicas. Este método se puede utilizar para cuantificar la enzima-catálisis. En este trabajo, el protocolo para la configuración instrumental, experimento en marcha, y el análisis de datos se describe generalmente, y se aplica a la caracterización de la hidrólisis enzimática de la urea por la ureasa jack bean.
Abstract
Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica bien descrito que mide el calor liberado o absorbido durante una reacción química, utilizando como una sonda intrínseca para caracterizar prácticamente todos los procesos químicos. Hoy en día, esta técnica se aplica ampliamente para determinar los parámetros termodinámicos de los equilibrios de unión biomoleculares. Además, el CCI se ha demostrado ser capaz de medir directamente la cinética y los parámetros termodinámicos (k gato, K M,? H) de las reacciones enzimáticas, a pesar de que esta aplicación es aún sin explotar. Como los cambios de calor se producen de forma espontánea durante la catálisis enzimática, el CCI no requiere ninguna modificación o etiquetado del sistema bajo análisis y se puede realizar en solución. Por otra parte, el método necesita poca cantidad de material. Estas propiedades hacen que el CCI una herramienta inestimable, poderosa y única para estudiar la cinética de enzimas en varias aplicaciones, tales como, por ejemplo, el descubrimiento de fármacos.
<p class = "jove_content"> En este trabajo un método basado en la ITC experimental para cuantificar la cinética y termodinámica de las reacciones enzimáticas se describe a fondo. Este método se aplica para determinar k gato y K M de la hidrólisis enzimática de la urea por Canavalia ensiformis (canavalia) ureasa. Se realiza Cálculo de la entalpía molar intrínseca (H int) de la reacción. Los valores así obtenidos son consistentes con los datos anteriores reportados en la literatura, lo que demuestra la fiabilidad de la metodología.Introduction
La determinación cuantitativa de las reacciones bioquímicas proporciona información detallada sobre los procesos biológicos en la base de la vida. Calorimetría ofrece una metodología libre de marca para caracterizar cuantitativamente virtualmente cada reacción química en la solución. Esta técnica mide el calor liberado o absorbido con el tiempo, y por lo tanto es un sistema de detección universal y una metodología muy conveniente para cuantificar la cantidad de moléculas que reaccionan (es decir, la termodinámica de unión), así como para medir la velocidad de reacción (es decir, la cinética). En particular, Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) ha sido adoptado como método de elección para caracterizar la termodinámica de los equilibrios biomoleculares, que implica la proteína-ligando, proteína-proteína, proteína de iones metálicos y la proteína-DNA 1.6. Además, la capacidad de CCI para proporcionar información cinética hace que sea un sistema muy potente para medir la catálisis enzimática, aunque el potencial de esta aplicación es todavíasubestimado 7-9.
La ecuación de Michaelis-Menten 10 es una descripción cuantitativa de las reacciones enzimáticas, ya que proporciona una relación entre la velocidad de reacción y la concentración de sustrato, dependiendo de dos parámetros cinéticos: la constante de Michaelis (K M) y la constante de velocidad catalítica (kcat) . El k cat / K proporción M se conoce como la eficiencia catalítica de una enzima. En la práctica, la determinación de K M y k gato para una reacción específica proporciona una descripción completa de la catálisis.
En una reacción enzimática típica (Figura 1), un sustrato (S) interactúa con la enzima (E) que forma el complejo enzima-sustrato (ES), que se activa posteriormente en el estado de transición (ES *). Este último se convierte en el complejo enzima-producto (EP) que, finalmente, se disocia. Estos pasoss se describen mediante la siguiente reacción.
(1)
donde k 1 es la constante de velocidad para la formación del complejo ES, k -1 es la constante de velocidad para la disociación del complejo ES, mientras que k gato es la constante de velocidad catalítica o número de recambio.
De acuerdo con la ecuación de Michaelis-Menten 10, la velocidad de la reacción se puede calcular como:
(2)
en la que M = K (k -1 + k gato) / k 1 y k cat = V max / [E], con v max siendo la velocidad máxima se alcanza cuando toda la enzima se une al sustrato.
El calorímetro de titulación isotérmica es el instrumento utilizado en este estudio para caracterizar la hidrólisis enzimática de la urea. Este instrumento es de un escudo adiabático que contiene dos células en forma de cuño (Figura 1). Estos están conectados al exterior con tubos de acceso estrechos. La celda de muestra (aproximadamente 1,4 ml) se carga con la solución de enzima, mientras que la celda de referencia es generalmente llena con agua o con el disolvente utilizado para el análisis. Una jeringa que gira con una aguja larga y una paleta de agitación adjunta, que normalmente contiene ca. 0,3 ml de solución de sustrato, está montado en la celda de muestra. Un dispositivo termoeléctrico mide la diferencia de temperatura entre la muestra y la celda de referencia y, utilizando una "red de realimentación de células", mantiene esta diferencia a cero por la adición o sustracción de calor. Durante el experimento, el sustrato se inyecta en la solución de enzima a una temperatura elegida constante. Cuando la lineaenzimáticos reacción tiene lugar, la cantidad de calor liberada o absorbida es proporcional al número de moléculas de sustrato que se convierten en moléculas de producto. Además, la tasa de flujo de calor está directamente relacionada con la velocidad de la reacción. Los datos medidos, que aparece como una desviación de la traza de calor de línea de base inicial (Figura 1), representan la potencia térmica (μcal / seg) suministrado por el instrumento para la celda de muestra, que es proporcional al flujo de calor se produce en la celda de muestra con el tiempo.
Figura 1. Representación esquemática de calorímetro de titulación isotérmica para estudiar las reacciones enzimáticas. Una reacción enzimática que ocurre durante la titulación del sustrato (en la jeringa de inyección) en la solución de enzima (en la celda de muestra) resulta en un cambio de la Therpoder mal lanzado por el calorímetro, necesaria para mantener la diferencia de temperatura entre la celda de muestra y la constante de celda de referencia. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
En general, el cambio de calor (Q) es proporcional a la entalpía molar de la reacción (H) y el número de moles de producto generado (N), que a su vez viene dada por los tiempos totales de volumen de la concentración:
(3)
La formación de producto a través del tiempo (dP / dt), que corresponde a la velocidad de reacción, puede por lo tanto estar relacionado con la cantidad de calor generado durante el mismo tiempo (dQ / dt) a través de la relación:
(4)
De acuerdo con esta ecuación, a fin de obtener una de Michaelis-Menten trazar es necesario medir i) el total delta H entalpía molar, y ii) el flujo de calor dQ / dt en diferentes concentraciones de sustrato. Por lo general, esto se realiza en dos experimentos diferentes: en el primer experimento (Método 1, M1), el sustrato se inyecta en la solución de enzima y se mide el calor para la conversión completa del sustrato; en el segundo experimento (Método 2, M2), múltiples inyecciones de sustrato se llevan a cabo y la tasa de producción de calor se mide a diferentes concentraciones de sustrato. Estos dos conjuntos de datos son suficientes para derivar los parámetros cinéticos K M y K gato.
En el presente artículo, un protocolo general para determinar los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas realizadas utilizando ITC se describe. Se aplicó el método de hidrólisis de la urea con urea Canavalia ensiformisse, como un sistema de referencia. La buena concordancia entre los resultados obtenidos con este método y los datos reportados en la literatura demuestra la fiabilidad de este enfoque.
Protocol
Representative Results
Discussion
Importancia de las TIC para estudiar la actividad enzimática con respecto a los métodos existentes
Además de sus aplicaciones clásicas para estudiar los equilibrios de unión, calorimetría de titulación isotérmica proporciona un método fiable y rápido para caracterizar reacciones enzimáticas en solución utilizando el calor de reacción como una sonda, sin requerir la modificación del sistema o etiquetado. Los parámetros cinéticos k gato y <e…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Especialidad de fertilizantes Products Company (SFP) es reconocida por proporcionar los fondos necesarios para este estudio.
Materials
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
Referencias
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
- Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).
- Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research–survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
- Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
- Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
- Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
- Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
- Walker, J., Wilson, K., Walker, J. . Principle and techniques of practical biochemistry. , 312-356 (2000).
- Ciurli, S., Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. . Nickel and its surprising impact in nature. 2, 241-278 (2007).
- Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
- Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
- Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
- Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
- Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
- Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
- Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
- Hausinger, R. P., Karplus, P. A., Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. . Handbook of Metalloproteins. , 867-879 (2001).
- Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
- Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
- Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
- Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
- Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
- Segel, I. H. . Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , (1993).
