Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

La détermination quantitative de réactions biochimiques permet de mieux comprendre les processus biologiques à la base de la vie. Calorimétrie propose une méthodologie sans étiquette pour caractériser quantitativement pratiquement toutes les réactions chimiques en solution. Cette technique mesure la chaleur dégagée ou absorbée au fil du temps, et est donc un système de détection universel et une méthodologie très pratique pour quantifier la quantité de molécules réagissant (c.-à-thermodynamique de liaison), ainsi que pour mesurer la vitesse de réaction (c.-à-cinétique). En particulier, calorimétrie de titration isotherme (ITC) a été adopté comme méthode de choix pour caractériser la thermodynamique des équilibres biomoléculaires, impliquant la protéine-ligand, protéine-protéine, protéine-ions métalliques et des interactions protéine-ADN ^1-6. En outre, la capacité de l'ITC de fournir des informations cinétique en fait un système très puissant pour mesurer la catalyse enzymatique, bien que le potentiel de cette application est encoresous-estimé ^7-9.

L'équation de Michaelis-Menten ¹⁰ est une description quantitative des réactions enzymatiques, car il fournit une relation entre la vitesse de réaction et la concentration du substrat, en fonction de deux paramètres cinétiques: la constante de Michaelis (K _M) et la constante de vitesse catalytique (k _cat) . Le k _cat / rapport K _M est mentionné comme l'efficacité catalytique d'une enzyme. Dans la pratique, la détermination de K et _M k _cat pour une réaction spécifique fournit une description complète de la catalyse.

Dans une réaction enzymatique typique (figure 1), un substrat (S) interagit avec l'enzyme (E) la formation du complexe enzyme-substrat (ES), qui est ensuite activé dans l'état de transition (ES *). Celui-ci est converti en le complexe enzyme-produit (EP) qui se dissocie éventuellement. Ces étapes sont décrits par la réaction suivante.

(1)

où k ₁ est la constante de vitesse pour la formation du complexe ES, _k-1 est la constante de vitesse de la dissociation du complexe ES, tandis que k _cat est la constante de vitesse catalytique ou le numéro de chiffre d'affaires.

Selon l'équation de Michaelis-Menten ^10, la vitesse de la réaction peut être calculé comme suit:

(2)

dans laquelle K = _{M (k-1} + k _cat) / k ₁ et k _cat = v _max / [E], avec v _max étant la vitesse maximale atteinte lorsque tous enzyme est lié au substrat.

La titration calorimétrique isotherme est l'instrument utilisé dans cette étude pour caractériser l'hydrolyse enzymatique de l'urée. Cet instrument est constitué d'un écran adiabatique contenant deux cellules en forme frappées (figure 1). Ceux-ci sont connectés à l'extérieur par des tubes d'accès étroits. La cellule de l'échantillon (environ 1,4 ml) est chargé avec la solution d'enzyme, tandis que la cellule de référence est généralement remplie avec de l'eau ou avec le solvant utilisé pour l'analyse. Une seringue en rotation avec une longue aiguille et une palette d'agitation attaché, contenant habituellement ca. 0,3 ml de solution de substrat, est monté sur la cellule d'échantillon. Un dispositif thermoélectrique mesure la différence de température entre l'échantillon et la cellule de référence et, à l'aide d'un "réseau de contre-réaction de la cellule", il maintient cette différence à zéro par addition ou soustraction de chaleur. Pendant l'expérience, le substrat est injecté dans la solution d'enzyme à une température constante choisie. Lorsque la sallezymatic réaction a lieu, la quantité de chaleur libérée ou absorbée est proportionnelle au nombre de molécules de substrat qui sont converties en molécules de produit. En outre, le taux de flux de chaleur est directement liée à la vitesse de la réaction. Les données mesurées, apparaissant comme un écart de la trace de la chaleur à partir de la ligne de base initiale (figure 1), représentent la puissance thermique (μcal / sec) fournie par l'instrument de la cellule d'échantillon, qui est proportionnel au flux de chaleur se produisant dans la cellule d'échantillonnage au fil du temps.

Figure 1. Représentation schématique de titration calorimétrique isotherme d'étudier les réactions enzymatiques. Une réaction enzymatique se produisant lors de la titration de substrat (dans la seringue d'injection) dans la solution d'enzyme (dans la cellule d'échantillon) a pour résultat un changement de la therpuissance mal dégagée par le calorimètre, nécessaire pour maintenir la différence de température entre la cellule de l'échantillon et la constante de la cellule de référence. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Dans l'ensemble, le changement de chaleur (Q) est proportionnelle à l'enthalpie molaire de la réaction (AH) et le nombre de moles de produit généré (n), qui à son tour est donné par le temps de volume total de la concentration:

(3)

La formation de produit avec le temps (dP / dt), qui correspond à la vitesse de la réaction, peut ainsi être liée à la quantité de chaleur engendrée pendant la même période (dQ / dt) par la relation:

(4)

Selon cette équation, afin d'obtenir un Michaelis-Menten Parcelle il est nécessaire de mesurer i) l'enthalpie molaire totale AH, et ii) l'écoulement dQ / dt de la chaleur à différentes concentrations de substrat. Habituellement, ceci est effectué dans deux expériences différentes: dans la première expérience (méthode 1, M1), le substrat est injecté dans la solution d'enzyme et de la chaleur pour la conversion complète du substrat est mesurée; dans la seconde expérience (méthode 2, M2), de multiples injections de substrat sont effectuées et le taux de production de chaleur est mesuré à différentes concentrations de substrat. Ces deux ensembles de données sont suffisantes pour calculer les paramètres cinétiques K _M et k _cat.

Dans le présent article, un protocole général pour déterminer les paramètres cinétiques pour les réactions enzymatiques réalisées à l'aide ITC est décrite. Nous avons appliqué la méthode à hydrolyse de l'urée par Canavalia de l'uréesoi, comme un système de référence. Le bon accord entre les résultats obtenus en utilisant cette méthode et les données rapportées dans la littérature démontre la fiabilité de cette approche.