Meten Spinal Presynaptische Remming in muizen door dorsale wortel Potentiële Recording<em> In Vivo</em
Summary
GABAergic presynaptische remming is een krachtig remmend mechanisme op het ruggenmerg belangrijk motorische en sensorische signalen integratie in ruggenmerg netwerken. Onderliggende primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van de dorsale wortel potentialen (DRP). Hier laten we een methode van in vivo opname van DRP in muizen.
Abstract
Presynaptische remming is een van de meest krachtige remmende mechanismen in de ruggenmerg. De onderliggende fysiologische mechanisme is een depolarisatie van primaire afferente vezels gemedieerd door GABAergic axo-axonale synapsen (primair afferente depolarisatie). De sterkte van de primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van volumes uitgevoerd potentialen op de dorsale wortel (dorsale wortel potentialen, DRP). Pathologische veranderingen van presynaptische inhibitie zijn cruciaal in de abnormale centrale verwerking van bepaalde pijn omstandigheden en in sommige aandoeningen van de motor hyperexcitatie. Hier beschrijven we een werkwijze voor opname DRP in vivo in muizen. De voorbereiding van het ruggenmerg dorsale wortels in het verdoofde dier en de opname procedure met behulp van zuig-elektroden worden toegelicht. Deze methode maakt het meten GABAergische DRP en daardoor het schatten van spinale presynaptische remming in de levende muis. In combinatie met transgene muismodellen, kan DRP opname serve als een krachtig instrument om ziekte-geassocieerde spinale pathofysiologie onderzoeken. In vivo opname heeft een aantal voordelen ten opzichte van ex vivo geïsoleerde ruggenmerg voorbereidingen, zoals de mogelijkheid van gelijktijdige opname of manipulatie van supraspinale netwerken en inductie van DRP door stimulatie van perifere zenuwen.
Introduction
Presynaptische remming is een van de meest krachtige remmende mechanismen in de ruggenmerg. Het remt prikkelende postsynaptische potentialen (EPSPs) in monosynaptically opgewonden motoneuronen zonder de postsynaptische membraan potentieel en de prikkelbaarheid van de motoneuronen 1-3. Primaire afferente depolarisatie (PAD) geïnduceerd door GABAergic axo-axonale synapsen op zintuiglijke presynaptische vezels is het onderliggende mechanisme 4-7 (zie ook Figure1A). Deze synapsen bevatten GABA A-en GABA B-receptoren (GABA A R en R GABA B). GABAA-R activiteit leidt tot een toename van chloride conductantie waarin PAD opwekt wegens lokaal ionenverdeling. Dit depolarisatie blokkeert de propagatie van actiepotentialen in de axon terminals en vermindert de kracht leidt tot een verminderde Ca2 +-influx en een vermindering van de afgifte van transmitter. Activering van GABA B-receptoren zich ert bijdragen aan PAD, maar leidt tot een vermindering van Ca 2 +-influx en zodoende het presynaptische remming. Terwijl de activering van GABA A R lijkt betrokken te zijn bij korte termijn remming, worden GABA B R betrokken bij langdurige modulatie 8-10. Naast GABA, die goed is voor het grootste deel van PAD en presynaptische remming kan andere zenders systemen ook moduleren en bijdragen mechanisme 11,12.
Pathologische veranderingen in presynaptische remming lijkt cruciaal te zijn in verschillende ziektetoestanden bijvoorbeeld perifere ontsteking en neuropathische pijn 13,14, alsook abnormale centrale pijn verwerking 15, ruggenmergletsel 16 en CNS ziekte met motorische hyperexcitatie gemedieerd door defecte GABA-erge transmissie 17, 18. Aldus schatten presynaptische remming nuttig experimentele pathologische condities te bestuderen op het ruggenmerg niveau vivo </em>. PAD leidt tot volume uitgevoerd potentialen die een directe maat van de presynaptische remming in het ruggenmerg. Die mogelijkheden zijn dorsale wortel potentials (DRP) genoemd en kan worden gemeten uit het ruggenmerg dorsale wortels na stimulatie van aangrenzende dorsale wortels 7.
Eerste metingen van DRP zijn gemeld bij katten en kikkers 19 en werden intensief bestudeerd bij katten door Eccles, Schmidt en anderen in de vroege jaren 1970 3,4,20,21. Terwijl in vivo opnames van DRP bij katten 22 es 23 ratten zijn op grote schaal gebruikt, metingen in muizen zijn bijna uitsluitend uitgevoerd in ex vivo geïsoleerde ruggenmerg voorbereidingen 15,24. Hier beschrijven we een methode om DRP nemen in verdoofde muizen in vivo waardoor een directe meting van presynaptische remming in het intacte organisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extra-en intracellulaire elektrofysiologische opnames van neuronale activiteit en synaptische potentialen in vivo zijn state of the art technieken in onderzoek CNS neuronale functies en pathofysiologie. Spinal integratie is van cruciaal belang voor de motoriek, zoals beweging van de ledematen en voor multimodale zintuiglijke waarneming. Presynaptische remming is een cruciaal mechanisme in deze computationele proces zorgen voor een passende reacties op zintuiglijke input. GABAergic synapsen op Ia affere…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Manfred Heckmann voor nuttige discussies tijdens vaststelling van de methode. Verder bedanken we Claudia Sommer voor technische bijstand en Frank Schubert voor ondersteuning produceren van de video. Het werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), Duitsland, FKZ: 01EO1002 en het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van Jena University Hospital.
Materials
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| (Melsungen, Germany) | |||
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| (Melsungen, Geramny) | |||
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| Stimulator | |||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Data acquisition | |||
| Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
Referencias
- Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
- Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
- Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
- Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
- Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
- Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
- Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
- Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
- Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
- Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
- Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
- Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
- Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
- Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
- Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
- Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
- Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
- Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
- Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
- Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
- Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
- Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
- Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
- Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).
